張璞 李曉林 薛燕 張慈現(xiàn) 向立麗 段雅雅 馮凱 付杰(通訊作者)

221009江蘇省徐州市中心醫(yī)院血液科

實用細胞凍存技術(shù)在自體造血干細胞移植中的應(yīng)用

張璞 李曉林 薛燕 張慈現(xiàn) 向立麗 段雅雅 馮凱 付杰(通訊作者)

221009江蘇省徐州市中心醫(yī)院血液科

目的：分析實用細胞凍存技術(shù)在自體造血干細胞移植中的應(yīng)用。方法：收集11例患者自體造血干細胞移植(AHSCT)動員的外周血造血干細胞，收集袋總?cè)萘?00～150 mL，其中二甲基砜(DMSO)占總?cè)萘康?0%、異體同型病毒滅活血漿占20%、外周血造血干細胞占70%。超凈臺無菌操作分裝后放置于-20℃的冰箱凍存12 h，再置于-80℃冰箱凍存。與常用凍存技術(shù)做對照，移植前復(fù)蘇干細胞，檢測細胞活性、單個核細胞計數(shù)(MNC)和CD34+細胞的回收率；移植后觀察患者粒細胞、血小板植入時間。結(jié)果：復(fù)蘇干細胞后檢測細胞活性(89.10±3.98)%，MNC和CD34+細胞的回收率分別為(91.84%±2.32)%和(90.59%±1.72)%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；移植后粒細胞中位植入時間+12 d、血小板中位植入時間+18 d，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論：DMSO與病毒滅活血漿是一種經(jīng)濟、易操作的干細胞冷凍保護劑。

細胞凍存；自體；造血干細胞

自體造血干細胞移植(AHSCT)因其移植相關(guān)死亡率低、無供者來源限制、無移植物抗宿主病，得到了廣泛的臨床應(yīng)用。進行AHSCT必須對患者實施自體造血干細胞動員、采集和干細胞凍存，在目前世界上每年開展的造血干細胞移植中，超過50%是AHSCT，因此干細胞凍存技術(shù)是成功進行AHSCT的關(guān)鍵。

資料與方法

2015年4月-2016年12月收治AHSCT患者11例，男7例，女4例，中位年齡41歲。移植前中位化療4個療程。所患疾病包括惡性淋巴瘤4例，其中彌漫大B細胞淋巴瘤復(fù)發(fā)2例，急性非淋巴細胞白血病(AML)5例，急性淋巴細胞白血病(Ph+ALL)2例。

預(yù)處理方案、外周血造血干細胞動員和采集[1]：白血病患者采用BU/CY方案(BU 0.8 mg/kg，每6 h 1次，-7～-4 d；CY 60 mg/kg，1次/d，-4～-3 d)進行預(yù)處理。淋巴瘤患者采用BEAC方案(BCNU 300 mg/m2，-6 d；VP-16 200 mg/m2，-5～-2 d；Ara-C 200 mg/m2，-5～-2 d；CTX 1800 mg/m2，-3～-2 d)，年齡較大的患者應(yīng)適當減少藥物劑量。動員化療后，待白細胞計數(shù)從最低值開始回升時給予重組人粒系集落刺激因子5～10 μg/(kg·d)皮下注射，如外周血CD34+細胞含量＞0.1%，開始使用COBESpectra(Gambro BCT公司)血細胞分離機分離干細胞，循環(huán)血量8～12 L/次，需1～2次。流式細胞儀計數(shù)CD34+細胞數(shù)，同時進行MNC，保證CD34+細胞數(shù)＞2.0×106/kg，MNC＞3.0×108/kg。

冷凍體系與復(fù)蘇：自體造血干細胞采集完畢后，按采集物總量加入20%的異體同型病毒滅活血漿和10%DMSO，混勻后分裝于凍存袋中，排盡空氣后封口，于-20℃放置12 h，于-80℃超低溫冰箱(海爾公司)低溫保存，于40℃恒溫水浴鍋復(fù)蘇后進行靜脈回輸，留取樣本檢測細胞活性、MNC和CD34+細胞的回收率。與文獻報道的常用凍存技術(shù)作對照。

造血功能重建監(jiān)測及隨訪：移植后隔天檢測血常規(guī)，血小板計數(shù)(Plt)≥20×109/L，中性粒細胞計數(shù)(ANC)≥0.5×109/L，作為造血功能重建的指標，與文獻報道的常用凍存技術(shù)做對照。采用電話、微信、門診隨診等多種形式長期隨訪。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果按(x±s)、中位數(shù)表示，均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

11例患者全部獲得造血重建，采集自體干細胞MNC 3.13～14.0×108/kg，平均(8.21±3.71)×108/kg；CD34+2.04～18.0×106/kg，平均(4.95±4.66)×106/kg。凍存干細胞時間22.0～47.0 d，平均(29.91±7.76)d。復(fù)蘇干細胞后細胞活性(89.10±3.98)%，MNC的回收率(91.84%± 2.32)%，CD34+回收率(90.59%±1.72)%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。自體移植后患者中性粒細胞計數(shù)(ANC)≥0.5×109/L的中位時間+12 d，血小板計數(shù)(PLT)≥20×109/L的中位時間+ 18 d，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。輸注過程中出現(xiàn)腹痛2例，寒戰(zhàn)1例，減慢輸注速度后緩解。

討論

根據(jù)采集造血干細胞的方式不同，AHSCT分為自體骨髓移植和自體外周血造血干細胞移植。AHSCT移植的特點是從外周血采集造血干細胞，簡單、方便、無需麻醉，不受骨髓轉(zhuǎn)移或接受放療造成損害的影響。自體外周血造血干細胞移植后的骨髓造血重建比自體骨髓移植恢復(fù)快、創(chuàng)傷小。目前有越來越多的醫(yī)院選擇從外周血采集造血干細胞。AHSCT治療惡性血液系統(tǒng)疾病比傳統(tǒng)化療有更顯著的優(yōu)越性，移植后絕大多數(shù)患者無需長期化療，延長了無病生存期，減少疾病復(fù)發(fā)，減輕了經(jīng)濟負擔，改善了患者的生存質(zhì)量[2，3]。

本研究動員方案采用強化療后，白細胞降至最低點以形成對骨髓造血的最強刺激。此時開始給予重組人粒細胞集落刺激因子，有利于對骨髓的快速再生長形成最佳動員時機，保證采集到足夠治療數(shù)量的外周血干細胞。采集外周血造血干細胞后，體外凍存過程中保證造血干細胞的活力對移植成功至關(guān)重要。造血干細胞凍存技術(shù)的應(yīng)用，可以使患者有充裕的時間選擇最佳預(yù)處理方案進行造血干細胞移植，凍存質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到移植成功率。造血干細胞的冷凍保存效果與冷凍保存劑的種類、濃度、降溫方法、貯存和融化過程，以及儲存的細胞濃度等都密切相關(guān)，選擇不同的冷凍保護劑及其濃度對外周血造血干細胞的保護有顯著差別[4]。傳統(tǒng)的外周血造血干細胞冷凍保存方法是在采集外周血造血干細胞后，將裝有采集完畢的外周血造血干細胞的采集袋放入冰水浴中，然后將造血干細胞低溫保護劑加入采集袋中充分混勻，低溫保護劑與外周血干細胞重量呈一定比例，分裝到100 mL外周血造血干細胞冷凍袋中，每個袋中空氣排盡后封口，放入-80℃冰箱中保存。傳統(tǒng)凍存方法中低溫保護劑在各家醫(yī)院采取的成分及混合比例不盡相同，目前文獻報道的主要有二甲基亞砜(DMSO)、右旋糖酐(Dextran)、白蛋白、營養(yǎng)素、羥乙基淀粉(HES)、自體血漿、RPMI1640等至少3種成分互相組合，DMSO所占濃度為5%或10%。相對于傳統(tǒng)方法，我們只采用10%DMSO和異體同型病毒滅活血漿組成低溫凍存液，在冷凍保護液中加入血漿既能提高保存質(zhì)量，又維持了細胞在凍融過程中的活力，分裝袋的數(shù)量也較以前相應(yīng)減少。有報道指出10%的DMSO濃度可能較高[5]，容易引起胃腸道反應(yīng)，血壓增高、心律失常等不良反應(yīng)，干細胞解凍后，輸注過程中可能誘生凝塊，導(dǎo)致干細胞回收率降低。對于DMSO的毒性作用，入選病例中1例72歲高齡的患者1次輸注700 mL凍存體系干細胞，未發(fā)生特殊不適。對于高齡患者，適當減慢輸注速度，能降低輸注的不適反應(yīng)，對移植后造血的恢復(fù)未產(chǎn)生明顯影響。采用該方法凍存外周血造血干細胞，復(fù)溫后細胞活性、有核細胞和CD34+細胞回收率均可達85%以上，移植患者均獲得造血重建，證明了該方法有很好的安全性及有效性。

綜上所述，改良新型凍存方法效果切實可靠、制作流程簡單、費用低廉，完全可以滿足臨床中較長時間保存外周血造血干細胞的要求，促進了血液惡性疾病治療學(xué)的發(fā)展。

[1]馮凱,許怡薇,葉扶光,等.自體外周血造血干細胞移植治療1型糖尿病的臨床觀察[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2011,91(28):1966-1969.

[2]Shi Y,Zhou S,He X,et al.Autologous hematopoietic stem cell transplantation in chemotherapy-sensitive lymphoblastic lymphoma: treatment outcome and prognostic factor analysis[J].Chin J Cancer Res,2015,27(1): 66-73.

[3]Helbig G,Krawczyk-Kulis M,Kopinska A,et al.Autologous hematopoietic stem cell transplantation for relapsed follicular lymphoma: safety profile and clinical outcome in a single-center experience[J].Med Oncol,2014,31 (12):310.

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[5]Svalgaard JD,Haastrup EK,Reckzeh K,et al. Low-molecular-weight carbohydrate Pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells[J].Transfusion, 2016,56(5):1088-1095.

Application of practical cell cryopreservation technique in autologous hematopoietic stem cell transplantation

Zhang Pu,Li Xiaolin,Xue Yan,Zhang Cixian,Xiang Lili,Duan Yaya,Feng Kai,Fu Jie(Corresponding author)
Department of Hematology,Xuzhou City Central Hospital of Jiangsu Province 221009

Objective:To analyze the application of practical cell cryopreservation technique in autologous hematopoietic stem cell transplantation.Methods:The mobilized peripheral blood stem cells of 11 patients with autologous hematopoietic stem cell transplantation(AHSCT)were selected.The total volume of collecting bag was 100～150 mL;the two methyl sulfone(DMSO) accounted for 10%of total volume;the allogeneic virus inactivated plasma accounted for 20%;the peripheral blood stem cell accounted for 70%.They were placed-20℃refrigerator for freezer 12 hours after ultra clean aseptic operation,placed-80℃refrigerator for freezer.Compared with the commonly used cryopreservation technique,the stem cells were given recovery before transplantation,and the cell activity,mononuclear cell count(MNC)and CD34+cell percent recovery were detected.After transplantation,the granulocyte and platelet implantation time of patients were observed.Results:After recovery stem cells,the cell activity was(89.10±3.98)%;MNC and CD34+cell percent recovery were(91.84%±2.32)%and(90.59%±1.72)%;there was no significant difference that compared with the control group(P＞0.05).After transplantation,the granulocyte median implantation time was+12 d;the platelet median implantation time was+18 d;there was no significant difference that compared with the control group(P＞0.05).Conclusion:DMSO and virus inactivated plasma is an economical and easy to use stem cell cryoprotectant.

Cell cryopreservation;Autologous;Hematopoietic stem cell

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.13.31

江蘇省高校自然科學(xué)研究項目(14KJB320027)

Fund ProjectJiangsu Province University Natural Science Research Project(14KJB320027)