李建文，李 曉，孫文秀*，李 偉，鞠 倩，曲明靜*，高華援，李春雨

(1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 2.山東省花生研究所/農(nóng)業(yè)部花生生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，山東 青島 266100； 3.吉林省農(nóng)科院花生研究所，吉林 長春 130124)

大灰象甲Sympiezomiasvelatus(Chevrolat)，又名大灰象、大灰象蟲、象鼻蟲，屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)斑鄂象甲亞科(Brachyrhininae)灰象屬(Sympiezomias)。主要分布于吉林、遼寧、甘肅、寧夏等地區(qū)，是花生的重要害蟲之一。大灰象甲食性雜，除花生外，該蟲還危害棉花、甜菜、玉米等多種農(nóng)作物[1-4]。2016-2017年連續(xù)兩年，該蟲在東北吉林花生產(chǎn)區(qū)均有嚴重危害，以成蟲潛入土壤土表取食嫩根、葉片，導(dǎo)致蟲洞、爛葉，缺苗斷壟以至絕收，嚴重田塊缺苗60%以上[5-9]。

昆蟲性信息素是由昆蟲某一性別個體分泌于體外，能被同種異性個體所接受，并引起異性個體產(chǎn)生一定的行為和生理反應(yīng)(如覓偶、定向求偶、交配等)的微量化學(xué)物質(zhì)，作為昆蟲交配過程中兩性相互尋找的重要紐帶和必備因素，因其專一、高效、持久、無毒、無污染、不傷害天敵等特點，近年來受到高度重視[10]，目前已有學(xué)者分離鑒定出多種鞘翅目昆蟲的性信息素組分[11-12]，甚至實現(xiàn)了田間應(yīng)用。然而大灰象甲的性信息素研究工作未見任何報道，防治仍以傳統(tǒng)農(nóng)藥為主，隨著昆蟲抗藥性隱患以及對環(huán)境污染的加劇，大灰象甲性信息素的研究工作迫在眉睫；同時，在國家化肥農(nóng)藥減量施用的大背景下，利用性信息素防治害蟲也呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在昆蟲性信息分離鑒定技術(shù)中，固相微萃取技術(shù)具有操作簡便、不需溶劑、萃取速度快、便于實現(xiàn)自動化以及易于色譜分析、需要樣品量少等特點，較適用于大灰象甲等性腺體不明的昆蟲類性信息素的分離鑒定。大灰象甲生活史長，在東北地區(qū)兩年發(fā)生一代，暫未實現(xiàn)人工飼養(yǎng)，因此性信息素取樣工作是在每年發(fā)生高峰期采集田間試蟲進行抽提，帶回室內(nèi)進行氣質(zhì)分析。為探索田間取樣方法，本研究采用直接萃取法和氣密針取樣法進行對比研究，旨在為下一步的性信息素分離鑒定工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

于2016年6月大灰象甲成蟲出土初期，采自吉林省扶余市弓棚子鎮(zhèn)花生產(chǎn)區(qū)，將田間采集的大灰象甲收集起來，雌雄分開，分組飼養(yǎng)在花生植株上，試驗時用玻璃罩隔離。

1.2 供試材料

試驗所用的玻璃罩采用長、寬、高分別為17cm×17cm×25cm長方體玻璃罩，使用前用蒸餾水及無水乙醇分別清洗三次后置于180℃下烘烤5 h；試驗所用的固相微萃取探針采用ZZ-SPME-06型萃取針以及DVB/CAR/PDMS型萃取頭；氣密針為潤澤流體100mL型；氣密袋采用海得科技MBT32-1型鋁塑復(fù)合氣體采樣袋。

1.3 取樣方法

1.3.1 直接萃取法

選取正在交配的大灰象甲10對，非求偶期大灰象甲10對作為對照，分別用長方體玻璃罩將其隔離起來，將固相微萃取探針懸掛于玻璃器皿內(nèi)萃取30 min后保存于冰盒內(nèi)帶回實驗室備用，實驗重復(fù)8次。

1.3.2 氣密針采集法

選取正在交配的大灰象甲10對，非求偶期大灰象甲10對作為對照，分別用玻璃器皿將其隔離起來，每隔5 min用氣密針采集器皿內(nèi)氣體100 mL注入氣密袋，采集6次，30 min后將氣密袋帶回實驗室，用固相微萃取探針萃取1 h，萃取探針保存于冰盒內(nèi)備用，實驗重復(fù)8次。

1.4 GC-MS分析

將上述兩種方法保存的固相微萃取探針分別送入安捷倫7890A/5975C型氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(青島貞正分析儀器有限公司)進行分析，進樣口溫度為220℃不分流，柱溫升溫程序為40℃，保持2 min，5℃/min升至100℃，再以10℃/min升至250℃，保持2 min，傳輸線為250℃，MS為35～400 m/z，解析時間為5 min。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行處理及統(tǒng)計分析，采用Origin 7.5軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

從GC-MS分析結(jié)果來看，兩種方法共檢出46種化合物(表1)，保留時間集中在7.40～30.32 min之間。兩種方法均能檢測到的化合物有5種，分別為：乙苯(Ethylbenzene)、對二甲苯(p-Xylene)、苯乙烯(Styrene)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2- tetrachloroethane)和苯酚(Phenol)。大多數(shù)化合物為含有雙鍵或三鍵的直鏈不飽和烯炔烴、帶環(huán)的酸酯、醇酯以及醛、酮類化合物。直接萃取法共檢出37種化合物(表2)，保留時間集中在7.78～30.32 min之間。在交配組樣本中單獨檢測到的化合物有24種，交配組和對照組中均檢出的化合物有13種。交配組含量顯著高于對照組的物質(zhì)有4種(圖1)，分別為癸醛(Decanal)、香橙烯氧化物(2)(Aromadendrene oxide-(2))、丁羥甲苯(Butylated Hydroxytoluene)和3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷(3-ethyl-5-(2-ethylbutyl)-octadecane)，其中癸醛、香橙烯氧化物(2)和3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷三種化合物的差異性達到極顯著水平。氣密針采集法檢出化合物14種(表3)，保留時間集中在7.40～23.68 min之間。在交配組大灰象甲的氣體樣本中單獨檢測到的化學(xué)物質(zhì)有2種，分別為壬醛(Nonanal)和2-壬烯-1-醇(2-Nonen-1-alcohol)；交配組和對照組樣品中均檢測到的化合物有12種，其中交配組含量高于對照

組的物質(zhì)有10種，其中差異性達極顯著水平的有8種，分別為乙苯(Ethylbenzene)、對二甲苯(p-Xylene)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2-tetrachloro-ethane)、苯酚(Phenol)、(E)-2-壬烯-1-醇( (E)-2-nonen-1-alcohol)、十四烷(Tetradecane)、4,4,5,6-四甲基四氫-1,3-惡嗪-2-硫酮(4,4,5,6-tetramethyltetrahydro-1,3-oxazin-2-thione)和癸酸癸酯(Decanoic acid decyl ester)(圖2)。

3 討 論

本文首次將固相微萃取技術(shù)應(yīng)用于大灰象甲性信息素分離鑒定，對取樣方法及性信息素組分進行了探索，由于大灰象甲尚未實現(xiàn)人工飼養(yǎng)，取樣前處理較為困難。本實驗采用直接采樣法和氣密針采樣法對大灰象甲的性信息素取樣，均能采集到一定數(shù)量的化合物，但種類與含量有較大差別。其中直接采樣法采集到37種化合物，種類較多，平均保留時間在15～30 min之間的化合物占73.0%；氣密針采樣法采集到14種化合物，平均保留時間為10～24 min的占比71.4%。兩種方法均分離到的化合物為乙苯、對二甲苯、苯乙烯、1,1,2,2-四氯乙烷和苯酚。分析兩種取樣方法導(dǎo)致化合物組分的差異，主要有以下幾個原因：其一，直接采樣法將萃取探針直接懸掛在玻璃器皿內(nèi)，萃取探針可能會吸附到土壤及花生植株釋放的氣味組分；其二，田間采樣萃取探針萃取后，探針需要在低溫環(huán)境下運輸至室內(nèi)上樣，這個過程可能會導(dǎo)致已萃取的化合物釋放或重萃取，導(dǎo)致一些無關(guān)組分的產(chǎn)生。而氣密針采集法將氣體采集到氣密袋中帶回實驗室萃取減少了上述可能無關(guān)化合物的干擾，因此更適于大灰象甲性信息素氣體樣本采集。此外，在花生田大背景下，無論何種方法都不能完全避免無關(guān)氣體化合物對實驗結(jié)果造成的干擾，因此下一步試驗應(yīng)盡量避免花生植株帶來的背景噪音。

對兩種方法分離鑒定到的性信息素組分進行分析發(fā)現(xiàn)，采集到的含苯環(huán)的化合物占30.43%，酯類化合物占23.91%，含醇類化合物占13.0%，酸類化合物占10.87%，其余的為長鏈烷烴以及少數(shù)醛酮類化合物。其中交配組與對照組均采集到的化合物中對二甲苯、1,1,2,2-四氯乙烷、苯酚等化合物的峰面積值較高，分析與土壤中殘留農(nóng)藥助溶劑中的甲苯、二甲苯以及含氯化合物有關(guān)[13-14]，而不是大灰象甲的性信息素組分。以往研究結(jié)果表明，昆蟲性信息素大部分是由兩種以上的化學(xué)物質(zhì)組成，鏈長一般為10～21碳，其中以12、14、16個碳原子居多，除了雙鍵外，大多數(shù)化合物一端有一個官能團，鞘翅目昆蟲性信息素組分多含有烯烴取代基，如樹莓象甲的性信息素組分有苧烯和α-蒎烯，蔓越橘象甲對(Z)-2-(3,3-二甲基-環(huán)己亞基)乙醇、(Z)-(3,3-二甲基環(huán)己亞基)乙醛和(E)-(3,3-二甲基環(huán)己亞基)乙醛敏感以及甘薯象甲性信息素組分含有[(Z)-3-十二碳烯基(E)-2-丁烯酸酯]等[15-17]。近緣種尤其是同屬種昆蟲性信息素結(jié)構(gòu)上有較大的相似性，因此，將大灰象甲性信息素組分的排查重點鎖定在含烯烴取代基的醇酯類化合物中，如：雙環(huán)[4.2.0]辛-1,3,5-三烯、10,12-十八碳二烯酸、E-12-甲基-2,13-十八碳二烯-1-醇、1,3,5,7-環(huán)辛四烯、香橙烯氧化物(2)、7-甲基-Z-十四碳烯-1-醇乙酸酯、2-壬烯-1醇、(E)-2-壬烯-1醇、9-十六碳烯酸等化合物，這對后期鑒定和驗證大灰象甲性信息素有一定的借鑒意義。

昆蟲性信息素是一類分泌極少的化學(xué)物質(zhì)，這使得微量成分的常規(guī)化學(xué)分析和檢測都很難，僅通過簡單的采集鑒定難以確定性信息素的具體成分[18-20]，要明確大灰象甲的性信息素組分還需要后期改進實驗方案、進一步進行電生理和風(fēng)洞等實驗驗證與鑒定。

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