羅秋水++周志娥++湯凱潔++李奔++劉鵬飛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.098

摘要：為研究并優(yōu)化野生魚(yú)腥草甲醇提取工藝及其體外抗氧化能力，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，通過(guò)方差分析、多重比較確定最優(yōu)提取工藝。用羥基自由基（·OH）的清除作用、總抗氧化能力、1，1-二苯基-2-苯基自由基（DPPH·）清除作用及清除亞硝酸鹽（NO-2）能力的測(cè)定方法評(píng)價(jià)甲醇提取物體外抗氧化活性。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶35 mL、提取時(shí)間1.0 h、提取溫度80 ℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)70%；甲醇提取物在0～1 mg/mL濃度范圍具有明顯的抗氧化活性，并且隨著濃度的增大，活性增強(qiáng)；當(dāng)甲醇提取物的濃度為1 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到50.23%，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)78.86%，對(duì)亞硝酸鹽的清除率高達(dá)8724%；與對(duì)照品維生素C相比，提取物的總抗氧化能力與其接近。因此可知，野生魚(yú)腥草甲醇提取物具有明顯體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：野生魚(yú)腥草；甲醇提取物；提取工藝；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0337-03

收稿日期：2015-09-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31101294）。

作者簡(jiǎn)介：羅秋水（1977—），男，江西樟樹(shù)人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail：lqsh2001@126.com。

通信作者：湯凱潔，博士，副教授，從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail：tkjie999@sina.com。魚(yú)腥草（Houttuyniae）別稱(chēng)紫蕺、野花麥、折耳根等，主要分布于中國(guó)中部、東南及西南部各省（區(qū)），以長(zhǎng)江以南各省份為主，包括川、鄂、贛、湘、黔等省[1]。魚(yú)腥草在民間傳統(tǒng)中醫(yī)上具有一定的藥用價(jià)值[2]，其中所含的功效成分包括黃酮類(lèi)化合物、揮發(fā)性物質(zhì)、多糖等，其中黃酮類(lèi)化合物包括榭皮素、榭皮苷、瑞諾苷、蕓香苷等[3]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，魚(yú)腥草廣泛應(yīng)用于治療肺膿瘍、痰熱咳嗽、尿路感染等。魚(yú)腥草的主要抗菌成分是魚(yú)腥草素，對(duì)各種致病菌、流感病毒等有抑制作用[4-6]，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用非常明顯。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥草有新的用途，如治療喘息型肺炎，此外對(duì)病毒性心肌炎、小兒呼吸感染均有療效。目前，隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)︳~(yú)腥草研究的深入，魚(yú)腥草化學(xué)成分的作用機(jī)理更加清晰，藥用價(jià)值及食用價(jià)值已被越來(lái)越多的人重視。魚(yú)腥草兼具食品保健功能特性，生物活性成分較高，與西藥相比具有特殊醫(yī)藥功效[7]，因此魚(yú)腥草的藥用價(jià)值、食用價(jià)值的前景將十分可觀。本研究通過(guò)魚(yú)腥草甲醇提取物的體外抗氧化活性試驗(yàn)，以期為野生魚(yú)腥草的進(jìn)一步充分利用提供參考和借鑒。

1材料與方法

1.1材料與試劑

野生魚(yú)腥草采摘于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)。鄰菲羅啉，天津永大化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苯基自由基（DPPH·），北京中生瑞泰科技有限公司；維生素C、無(wú)水乙醇、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、檸檬酸、草酸、磷酸鈉、氨基苯磺酸鈉，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

723可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；BS224S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DZG-6020真空干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；移液器，Thermos；SB-3200DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV752紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海諾科儀器儀表有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XY-200高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市松青五金工具廠；TCL5M臺(tái)式低速大容量冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.3野生魚(yú)腥草甲醇提取工藝優(yōu)化

1.3.1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)稱(chēng)取1.0 g魚(yú)腥草粉末，以甲醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1 g ∶mL、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1 h為單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。當(dāng)研究某一因素時(shí)，使其他條件保持不變。甲醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)為50%、60%、70%、80%、90%，料液比分別設(shè)為1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL、1 g ∶40 mL，提取時(shí)間分別設(shè)為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取溫度分別設(shè)為50、60、70、80、90 ℃。按上述設(shè)計(jì)分別做單因素不同水平的試驗(yàn)，所得提取物在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，按照下面公式計(jì)算提取物得率：

提取物得率=（m2-m1）/m0×100%。

式中：m2為空瓶+提取物質(zhì)量，g；m1為空瓶質(zhì)量，g；m0為樣品質(zhì)量，g。

1.3.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為了綜合考慮各因素對(duì)野生魚(yú)腥草甲醇提取物得率的影響，根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素，采用 L9（34） 正交設(shè)計(jì)對(duì)野生魚(yú)腥草甲醇提取條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素水平詳見(jiàn)表1。

1.4野生魚(yú)腥草甲醇提取物的測(cè)定

1.4.1野生魚(yú)腥草甲醇提取物的制備及提取得率計(jì)算將野生魚(yú)腥草清除黃葉、洗凈、烘干、剪碎、粉碎后放入干燥器中

1.4.2甲醇提取物濃度和對(duì)照品維生素C的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取0.500 g甲醇提取物，配制成濃度為1 000 μg/mL的樣品溶液，并以此為基準(zhǔn)，逐步稀釋配制200、400、600、800、1 000 μg/mL 的樣品溶液。按同樣方法配制同樣系列濃度梯度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，將二者存儲(chǔ)于冰箱備用。

1.4.3對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用參考鄰二氮菲-金屬離子-H2O2[8]，同時(shí)采用Fenton反應(yīng)（H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+）獲得羥基自由基，反應(yīng)過(guò)程中將鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，在 510 nm 處最大吸收峰消失，從而可以在510 nm處測(cè)其吸光度，通過(guò)測(cè)定樣品在該波長(zhǎng)處的吸光度可判斷羥基自由基存在的量，并以此計(jì)算羥基自由基清除率。具體方法：（1）取磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH值=7.4）2.0 mL于試管中并加入8.0 mL蒸餾水，搖勻作為空白管；（2）取2.0 mL磷酸鹽緩沖液、1.5 mL 5 mmol/L鄰二氮菲、1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵和5.5 mL蒸餾水于試管中，搖勻作為未損傷管A；（3）以A管為基準(zhǔn)，在此基礎(chǔ)上加入0.1% H2O2 1.0 mL、蒸餾水 4.5 mL，搖勻作損傷管并標(biāo)記為B；（4）以B管為基準(zhǔn)，在該基礎(chǔ)上分別加入1.0 mL各樣品溶液，搖勻后作為樣品管并標(biāo)記為C；（5）將上述所有試管混勻后置于37 ℃恒溫水鍋中保溫30 min，然后取出并定容到10 mL，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算各個(gè)濃度對(duì)羥基自由基清除率：

·OH清除率=[（DC-DB）/（DA-DB）]×100%。（1）

1.4.4清除亞硝酸鹽（NO-2）的能力[9-10]分別取3 mL各濃度的樣液加入到具塞試管中，用檸檬酸緩沖液（pH值=3.0）定容至5 mL。分別向每支管中加入0.1 mL亞硝酸鈉（200 μg/mL），混勻后立即置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫 1.5 h。同時(shí)，空白管不加亞硝酸鈉；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)管不加亞硝酸鈉及樣品，其余相同。通過(guò)鹽酸萘乙二胺比色法[11]測(cè)定各管的吸光度（D540 nm）。根據(jù)以下公式計(jì)算各個(gè)濃度對(duì)亞硝酸鹽（NO-2）的清除率：

NaNO2清除率= [D標(biāo)-（D樣-D空）]/D標(biāo)×100%。（2）

1.4.5清除DPPH·的清除作用[12]甲醇提取物清除DPPH·能力的測(cè)定：取10 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，用95%乙醇為溶劑配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液；各取1 mL甲醇提取物樣液于試管中，然后迅速加入3 mL配制好的DPPH乙醇溶液，快速搖勻并且置于室溫陰暗處反應(yīng)30 min；然后將反應(yīng)后各管迅速取出并在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)定吸光度（Da）；同時(shí)按上述比例分別測(cè)定溶劑與DPPH混合后的吸光度（Dc）、試劑與樣液混合后的吸光度（Db）。按下式計(jì)算DPPH·清除率：

DPPH·清除率=[1-（Da-Db）/Dc]×100%。（3）

1.4.6總抗氧化力各取0.4 mL不同濃度的魚(yú)腥草甲醇提取液加入試管中，然后依次加入28 mmol/L磷酸鈉、0.6 mol/L 硫酸、4 mmol/L鉬酸銨，各4 mL，混勻后并置于 95 ℃ 恒溫水浴鍋中90 min，然后冷卻至室溫并在波長(zhǎng) 695 nm 處測(cè)其吸光度；以蒸餾水組作為空白管，所有測(cè)定均做3次平行試驗(yàn)[13]。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)提取時(shí)間為0.5～1.5 h時(shí)，甲醇提取物得率增加速度較快；當(dāng)提取時(shí)間1.5～2.5 h時(shí)，甲醇提取物得率變化趨勢(shì)有增有減。從節(jié)省時(shí)間來(lái)考慮，選取提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0 h 做正交試驗(yàn)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，甲醇提取物得率最大，之后得率明顯下降。從提取效果、減少溶劑用量考慮，分別選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%做正交試驗(yàn)。當(dāng)提取溫度為40～50 ℃時(shí)，甲醇提取物濃度較快增加至最大值，之后甲醇提取物濃度先降低再升高。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選取溫度70、80、90 ℃做正交試驗(yàn)。甲醇提取物得率隨料液比增加一直增大，在料液比為1 g ∶30 mL后增大緩慢。從提取效果和減少溶劑用量角度考慮，分別選擇料液比為 1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL做正交試驗(yàn)。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果、方差分析及多重比較

由表2正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)可知，通過(guò)極值R大小得出各因素對(duì)提取物提取得率影響大小依次為料液比>甲醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取溫度。由表3方差分析可知，料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素對(duì)提取物提取率的影響都極顯著。由表4多重比較得出，最佳提取工藝為A3B1C2D2、A3B3C2D2。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，得出A3B1C2D2提取率最大，比正交表中的任何值還大，所以選擇最佳提取工藝條件為A3B1C2D2，此時(shí)提取得率為19.13%。

2.3對(duì)羥基自由基的清除作用

由圖1可知，甲醇提取物對(duì)羥基自由基的清除作用隨著濃度增加逐漸增大；當(dāng)濃度在0～600 μg/mL范圍內(nèi)， 清除率呈直線增加；當(dāng)濃度在600～800 μg/mL時(shí)，其清除率明顯加快；之后的清除率略有增加但趨勢(shì)變緩，在1 000 μg/mL濃度下維生素C對(duì)羥基自由基清除率達(dá)到75.49%，而樣品清除率為50.23%。

2.4總抗氧化能力

自由基含有1個(gè)不成對(duì)的電子原子團(tuán)，在形成分子時(shí)，自由基就會(huì)奪取其他物質(zhì)的1個(gè)電子， 從而使自己變得更加穩(wěn)定，這種現(xiàn)象稱(chēng)為氧化[14]。由圖2可以看出，魚(yú)腥草甲醇提取物D695 nm在濃度0～1000μg/mL范圍內(nèi)隨濃度增大而提高，其總抗氧化能與維生素C基本平行增大且接近。

2.5對(duì)DPPH·的清除作用

DPPH·乙醇溶液呈紫色，最大吸收波長(zhǎng)為517 nm。當(dāng)加入自由基清除劑到DPPH溶液中時(shí)，其孤電子成對(duì)，吸收消失或減弱，從而使溶液顏色變淺，并在517 nm處的吸光度變化趨勢(shì)與自由基清除率呈線性相關(guān)。因此，該法可以用來(lái)檢測(cè)某種物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力，清除率越大則證明其清除自由基能力越強(qiáng)。由圖3可以看出，甲醇提取物對(duì)DPPH·清除率在0～1 000 μg/mL范圍內(nèi)一直增大，當(dāng)濃度為 1 000 μg/mL 時(shí)，清除率達(dá)78.86%；對(duì)照品維生素C對(duì) DPPH· 清除率與甲醇提取物趨勢(shì)基本相同，但相比之下后者的清除效果更好，在1 000 μg/mL時(shí)清除率高達(dá)92.78%。

2.6清除亞硝酸鹽（NO-2）的能力亞硝胺類(lèi)物質(zhì)能引起諸多慢性或惡性腫瘤。雖然在正常情況下，人們直接攝入該類(lèi)致癌物的量幾乎可以忽略，但食物中可形成N-亞硝胺類(lèi)的前體物質(zhì)卻大量存在，其中亞硝酸鹽是能夠形成N-亞硝胺類(lèi)的前體物質(zhì)[15]。由圖4可以看出，在0～200 μg/mL范圍內(nèi)，維生素C對(duì)亞硝酸的清除能力均隨著濃度的增加迅速增大，之后增加比較平緩；當(dāng)濃度升高到1 000 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到96.75%；甲醇提取物的濃度在0～200 μg/mL時(shí)清除亞硝酸的能力先增大后基本保持不變；但是當(dāng)濃度達(dá)到600 μg/mL后，其清除能力又迅速增大，并且在1 000 μg/mL時(shí)清除率高達(dá)87.24%。

3結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)提取物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)提取物得率影響均差異極顯著。各因素對(duì)提取物得率影響排序?yàn)榱弦罕?gt;甲醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取溫

度。通過(guò)方差分析和多重比較后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可知最佳工藝參數(shù)：料液比為1 g ∶35 mL、提取時(shí)間為1.0 h、提取溫度為 80 ℃、甲醇濃度為70%，此時(shí)提取得率為19.13%。

甲醇提取物在0～1 000 μg/mL濃度范圍內(nèi)有較明顯的抗氧化活性，各指標(biāo)活性隨著濃度的增加而增強(qiáng)；當(dāng)甲醇提取物的濃度為1 000 μg/mL時(shí)，甲醇提取物對(duì)羥基自由基清除率為50.23%，對(duì)1，1-二苯基-2-苯基自由基的清除率達(dá)到78.86%，對(duì)亞硝酸鹽（NO-2）的清除率高達(dá)87.24%；甲醇提取物的總抗氧化能力和濃度呈正相關(guān)，與對(duì)照品維生素C相比，總抗氧化力變化趨勢(shì)基本接近。

參考文獻(xiàn)：

[1]高靜，周日寶，王朝暉. 魚(yú)腥草的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J]. 湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25（6）：60-61.

[2]全國(guó)中草藥匯編編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編·上冊(cè)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：553-554.

[3]胡鳳蓮，倪細(xì)爐，劉文哲. 魚(yú)腥草中總黃酮和槲皮素含量的動(dòng)態(tài)變化[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，36（增刊2）：91-94.

[4]宗曉萍. 魚(yú)腥草有效成分的研究[D]. 成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2005：20-23.

[5]陳春花，臧瑩安，李榮譽(yù). TMP對(duì)魚(yú)腥草抑菌效果的影響[J]. 中醫(yī)醫(yī)藥雜志，2002，20（1）：16-18.

[6]熊大勝，席在星，鄧應(yīng)威. 魚(yú)腥革提取物抑菌作用研究[J]. 常德師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，14（4）：59-60.

[7]蘇金祥，石磊. 魚(yú)腥草注射液的藥理及臨床應(yīng)用[J]現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，13（17）：2360-2361.

[8]李小定，榮建華，吳謀成. 灰樹(shù)花多糖PGF-1體外對(duì)羥基自由基的抑制作用[J]. 食品科學(xué)，2003，24（7）：126-130.

[9]張庭延，聶劉旺，陶瑞松，等. 三種植物多糖的抗氧化活性研究[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25（1）：56-58.

[10]朱萍萍，廖慧珍. 麥草食品抗氧化作用初步研究[J]. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，31（1）：40-43.

[11]高鶴娟. 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法（理化部分）注釋[M]. 北京：衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所，1987：244.

[12]譚萍，方玉梅，王毅紅，等. 苦蕎種子黃酮類(lèi)化合物清除DPPH自由基的作用[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（12）：20-23.

[13]朱萍萍，廖慧珍. 麥草食品抗氧化作用初步研究[J]. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，31（1）：40-43.

[14]方允中，鄭榮梁. 自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用[M]. 北京：科學(xué)出版社，2002.

[15]張英，丁霄霖. 竹葉有效成分和抗活性氧自由基效能的研究 [J]. 竹子研究匯刊，1996（3）：17-24.