酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與耐酸脅迫能力的相關(guān)性分析

陳其玲，任曉寧，王 玲，田 雨，趙美靜，宋巧智，劉樹(shù)文,2,3,*

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與耐酸脅迫能力的相關(guān)性分析

陳其玲1，任曉寧1，王 玲1，田 雨1，趙美靜1，宋巧智1，劉樹(shù)文1,2,3,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)中心，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 渭南 715300）

目的：β-葡萄糖苷酶是葡萄酒中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)釋放的關(guān)鍵酶，但其活性受諸多因素的影響。本研究旨在從酒酒球菌自身耐酸能力的視角去分析評(píng)估菌株糖苷酶活性，探索酸脅迫下不同耐酸表型酒酒球菌與其β-葡萄糖苷酶活性之間存在的相關(guān)性關(guān)系。方法：結(jié)合利用離子注入誘變與脅迫環(huán)境篩選的方式，獲得耐酸（pH 3.0）、酸敏（pH 9.0）突變酒酒球菌菌株，對(duì)其β-葡萄糖苷酶的活力進(jìn)行測(cè)定，并篩選3 組酸脅迫下表型差異大的β-葡萄糖苷酶基因送樣測(cè)序。結(jié)果：耐酸突變酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶酶活力是出發(fā)菌株的2～4 倍，是相應(yīng)酸敏突變株的2～7 倍。測(cè)序結(jié)果顯示，除菌株a3的β-葡萄糖苷酶基因在108位（G置換成C）和1 232（A置換成T）位處發(fā)生了突變外，其余菌株β-葡萄糖苷酶的基因均未發(fā)生改變。結(jié)論：酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與菌株酸脅迫能力顯著相關(guān)（P＜0.05）。耐酸脅迫能力越強(qiáng)的菌株，β-葡萄糖苷酶活性越高。

酒酒球菌；離子注入誘變；酸脅迫；β-葡萄糖苷酶；相關(guān)性分析

葡萄酒的香氣是評(píng)價(jià)葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。在麝香類(lèi)的葡萄酒中，萜烯醇（尤其是單萜烯）是構(gòu)成葡萄酒典型品種香氣的重要化合物[1-2]。但是，多數(shù)萜烯醇在葡萄酒中通常與糖以糖苷的形式結(jié)合，因而不能表現(xiàn)出其香氣特征[3]。在葡萄酒生產(chǎn)中，常采用酶促水解法分解風(fēng)味前體物質(zhì)以增強(qiáng)其香氣濃度及復(fù)雜性。通常情況下，糖苷類(lèi)物質(zhì)的水解需要多種糖苷酶共同參與完成，其中β-葡萄糖苷酶是結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)釋放的關(guān)鍵酶[4-7]。

葡萄酒中的乳酸菌，尤其是酒酒球菌代謝產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)的提升效果尤為顯著[8-10]。但是，葡萄酒生境十分惡劣且復(fù)雜，高酸、高酒精、高二氧化硫、低糖環(huán)境等都會(huì)對(duì)糖苷酶活性產(chǎn)生影響[11-14]。目前的研究多是針對(duì)外界脅迫條件對(duì)酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的影響，鮮有對(duì)酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與菌株自身耐酸脅迫能力進(jìn)行相關(guān)性研究。

因此，本研究通過(guò)離子注入誘變對(duì)3 株酒酒球菌進(jìn)行離子注入，并于pH 3.0脅迫環(huán)境篩選耐酸突變株，于pH 9.0脅迫環(huán)境篩選酸敏突變株。通過(guò)比較這些耐酸差異菌株及其出發(fā)菌株的β-葡萄糖苷酶的β-葡萄糖苷酶活性，分析研究酒酒球菌的抗酸脅迫能力與其β-葡萄糖苷酶活性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌種

3 株酒酒球菌Oenococcus oeni SX-1a[15]、SX-1b[15]、CS-1b[16]由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院保藏。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

酸性番茄汁培養(yǎng)基（acid tomato juice broth，ATB）（1 L）：番茄汁250 mL、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖10 g、MgSO40.2 g、MnSO40.05 g、鹽酸半胱氨酸0.5 g。固體培養(yǎng)基再加入瓊脂27 g，所有培養(yǎng)基再使用前均需在121 ℃條件下滅菌20 min，滅菌后用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。

對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）、對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

AIR TECH超凈臺(tái) 中國(guó)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MJ-250B培養(yǎng)箱、H-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5417R1冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Nanodrop1000紫外分光光度計(jì)、Orion Star A111 pH計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；SS325滅菌鍋 日本Tomy公司；多功能復(fù)合離子注入機(jī) 成都同創(chuàng)材料表面新技術(shù)工程中心。

1.4 方法

1.4.1 菌株的誘變處理

菌體懸浮液的制備：挑取平板中的單個(gè)菌落（原始菌株）接入10 mL ATB液體培養(yǎng)基。以4%的接種量將活化種子液轉(zhuǎn)接于10 mL ATB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化。

離子注入：將制備好的菌體懸浮液0.1 mL均勻涂布于9 cm的無(wú)菌空白培養(yǎng)皿中央，置于超凈臺(tái)下，用無(wú)菌風(fēng)吹干備用。將均勻涂布有菌體并吹干的培養(yǎng)皿置于離子注入小靶室內(nèi)，注入離子N＋，能量為50 keV，注入靶室的真空度為10－3ions/cm2。

1.4.2 菌株的篩選

經(jīng)離子注入后的樣品，用1 mL無(wú)菌水沖洗后，分別轉(zhuǎn)入到pH 3.0和pH 9.0的液體脅迫ATB培養(yǎng)基中，于26 ℃條件下培養(yǎng)，并在同樣脅迫環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)12 代后，于pH 4.8固體ATB培養(yǎng)基上通過(guò)劃線的方法進(jìn)行兩次分離純化。最終獲得的單菌落于pH 4.8 ATB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，將活化后的菌液再次接種到相應(yīng)脅迫培養(yǎng)條件下（pH 3.0和pH 9.0），連續(xù)培養(yǎng)12 代，獲得性狀穩(wěn)定的純化菌株。

1.4.3 酒酒球菌誘變菌株酸脅迫生長(zhǎng)曲線繪制

將誘變菌株及其出發(fā)菌株于10 mL pH 4.8液體ATB培養(yǎng)基中26 ℃靜置培養(yǎng)，活化2 代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌體（A600nm＝1.0），并以4%接種量接種到pH 3.0液體ATB培養(yǎng)基中，繪制菌株酸脅迫生長(zhǎng)曲線。

1.4.4 β-葡萄糖苷酶樣品的制備

按照1.4.3節(jié)中活化好的菌株，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（A600nm＝1.2）菌液各1 mL，10 000 r/min 離心10 min得菌體，將菌體用0.85% NaCl溶液洗滌2 次，最后使其懸浮于0.5 mL的0.85% NaCl溶液中。

1.4.5 β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定

β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定方法參照Barbagallo等[12]的方法略作修改。反應(yīng)體系（3 mL）為：吸取0.5 mL檸檬酸磷酸緩沖液-pNPG混合液（pH 5.0，pNPG濃度5 mmol/L），加入1.4.4節(jié)制備的懸浮菌體0.5 mL，混合后于37 ℃條件下反應(yīng)1 h，立即加入2 mL 1 000 mmol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。10 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一試管中。使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定其在400 nm波長(zhǎng)處的吸光度。對(duì)照樣品用0.85% NaCl緩沖液代替菌懸液制備，其他處理與樣品相同。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)測(cè)定不同濃度（0～60 μmol/L）pNP溶液在400 nm波長(zhǎng)處的吸光度獲得。菌體干質(zhì)量按以下公式計(jì)算：

式中：A600nm為600 nm波長(zhǎng)處菌懸液的吸光度；2.616 8為固定系數(shù)。

=δ[σ(α(x)),[σ(y),σ(z)]-σ([y,z])]-[σ(α(y)),[σ(x),σ(z)]-σ([x,z])]

β-葡萄糖苷酶活力定義為每克菌體（干質(zhì)量）每分鐘生成pNP的物質(zhì)的量/（μmol/（g·min））。

pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在1～60 μmol/L濃度范圍內(nèi)，回歸方程為y＝0.018 8x＋0.027 4，R2＝0.999 5，線性關(guān)系良好，滿足實(shí)驗(yàn)需求。

1.4.6 β-糖苷酶基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[1 6]設(shè)計(jì)的引物，由生工生物（上海）股份有限公司合成：b g l-F：5’-GTGACTATGGTAGAGTTTCC-3’；bgl-R：5’-TCAAAACCCATTCCGTTCCCCA-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離（電壓80 V），電泳結(jié)束后將凝膠放在全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)中，拍照并分析。

對(duì)所有供試菌株β-葡萄糖苷酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并篩選菌株酶活及抗酸表型差異較大的菌株，將其酶切產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司純化并測(cè)序。然后，利用生物信息學(xué)分析軟件MAGA 6.0將所有測(cè)序糖苷酶基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，并提交到GenBank上。以確保酶活力的差異并不是由于誘變?cè)斐傻奶擒彰富蛲蛔兯稹?/p>

1.5 數(shù)據(jù)處理

酶活力為3 次測(cè)定的平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變菌株

離子注入誘變獲得的誘變菌株、相應(yīng)的誘變劑量和后期篩選條件見(jiàn)表1。

表1 誘變菌株Table1 Information about O. ooeennii mutants

離子注入誘變育種具有高突變率、突變譜廣、性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)[17]。經(jīng)離子注入菌株轉(zhuǎn)入pH 3.0低酸脅迫環(huán)境下培養(yǎng)，分離純化后共獲得5 株突變菌，其中SX-1a突變菌1 株、SX-1b突變株2 株、CS-1b突變株2 株；pH 9.0堿脅迫條件下分離純化后獲得突變株5 株，其中SX-1a 2 株、SX-1b 1 株、CS-1b 2株，所有純化后的突變菌株都再次經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)（不少于12代），確保獲得的突變株具有穩(wěn)定的耐酸/酸敏性狀。其中，出發(fā)菌株SX-1a、SX-1b、CS-1b在pH 3.0以及pH 9.0脅迫環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)3～5 代后，菌株基本已經(jīng)喪失活性。

2.2 酸脅迫環(huán)境下菌體的生長(zhǎng)曲線

圖1 酒酒球菌SX-1a（a）、SX-1b（b）、CS-1b（c）及其誘變株在酸脅迫環(huán)境中的生長(zhǎng)曲線（pH 3.0 ATB培養(yǎng)基）Fig. 1 Growth curves of O. oeni SX-1a (a), SX-1b (b), CS-1b (c) and corresponding mutants cultured in ATB medium (pH 3.0)

由圖1可知，pH 3.0低酸性脅迫環(huán)境中，篩選獲得的突變株b1、a3、c1和c2在穩(wěn)定期的生物量（即A600nm值）高于對(duì)應(yīng)的出發(fā)菌株SX-1b、SX-1a、CS-1b。而于pH 9.0堿性脅迫環(huán)境中篩選獲得的突變株b2、a1-1、a1-2、c2-1、c2-2，在穩(wěn)定期的生物量則低于對(duì)應(yīng)的出發(fā)菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，篩選自pH 3.0環(huán)境的突變株（即耐酸突變株）耐酸脅迫能力高于出發(fā)菌株，而篩選自pH 9.0環(huán)境的突變株（即酸敏突變株）耐酸脅迫能力低于出發(fā)菌株。

葡萄酒的高酸環(huán)境是限制乳酸菌活性的重要因素之一[18-19]。酒酒球菌能否耐受葡萄酒酒體的高酸環(huán)境，直接決定著菌體能否在酒體環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖、啟動(dòng)并主導(dǎo)完成蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵、代謝產(chǎn)生糖苷酶酶解糖苷等[20-21]。在某些冷涼產(chǎn)區(qū)，蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵強(qiáng)葡萄酒的pH值較低，約為2.5～3.0。Tourdot-Maréchal等[22]研究顯示，當(dāng)

酒酒球菌暴露于pH 3.2脅迫環(huán)境時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制。本實(shí)驗(yàn)篩選獲得的耐酸突變株b1、a3、c1和c2在pH 3.0低酸環(huán)境中，累積最大生物量（穩(wěn)定期A600nm值）與出發(fā)菌株在最適環(huán)境（pH 4.8）中的能夠達(dá)到的最大生物量相近（SX-1b、SX-1a、CS-1b在pH 4.8環(huán)境下，穩(wěn)定期A600nm值分別是1.538、1.828和1.611）。結(jié)果表明，耐酸突變菌株在酸脅迫環(huán)境中表現(xiàn)出很強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。

2.3 不同菌株β-葡萄糖苷酶活力的比較

表2 酒酒球菌CS-1b及其誘變菌株β-葡萄糖苷酶活力Table2 β-Glycosidase activities ofO. ooeennii CS-1b and the corresponding mutants

以pNPG為反應(yīng)底物，于37 ℃條件下反應(yīng)1 h，測(cè)定13 株酒酒球菌中β-葡萄糖苷酶活力。由表2可知，耐酸突變株c1、c2的β-葡萄糖苷酶活力高于出發(fā)菌株，其中突變株c1的酶活力最高，是出發(fā)菌株酶活力的1.69 倍。而酸敏突變株c2-1、c2-2的β-糖苷酶活力低于出發(fā)菌株CS-1b，其中c2-1的酶活力最低，僅是出發(fā)菌株酶活力的45.25%，是耐酸突變菌株c1酶活力的26.85%。

表3 酒酒球菌SX-1b及其誘變菌株β-葡萄糖苷酶活力Table3 β-Glycosidase activitiesof O. oeennii SX-1b and the corresponding mutants

由表3可知，耐酸突變株b1、b3的β-葡萄糖苷酶活力高于出發(fā)菌株SX-1b，其中突變株b1的酶活力是出發(fā)菌株酶活的4.47 倍，是突變株b3酶活力的1.95 倍，是突變株b2酶活力的7.50 倍。突變株b2的β-糖苷酶活力最低，僅是出發(fā)菌株酶活力的59.35%。

表4 酒酒球菌SX-1a及其誘變菌株β-葡萄糖苷酶活力Table4 β-Glycosidase activity ofO. oeennii SX-1a and the corresponding mutants

由表4可知，突變株a3的β-葡萄糖苷酶活力最高，是出發(fā)菌株SX-1a酶活力的2.54 倍，是突變株a1-1酶活力的2.82 倍，是突變株a1-2酶活力的2.5 倍。結(jié)果顯示，酸脅迫能力強(qiáng)的菌株（如a3、b1、

c1），其β-葡萄糖苷酶活力遠(yuǎn)高于酸敏突變株。這可能是因?yàn)橄噍^于酸敏突變株，耐酸突變株在低酸環(huán)境中具有較強(qiáng)的維持胞內(nèi)pH值平衡的能力，而細(xì)胞內(nèi)酸堿穩(wěn)定的狀態(tài)能夠確保參與菌株各個(gè)代謝系統(tǒng)的酶活性[23-25]，使各代謝有條不紊的進(jìn)行，從而維持了菌株的正常生長(zhǎng)繁殖。且當(dāng)O. oeni各項(xiàng)生理機(jī)能維持正常水平時(shí)，其參與的蘋(píng)果酸代謝、氨基酸代謝等反過(guò)來(lái)幫助調(diào)控細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡、維持細(xì)胞內(nèi)的pH值平衡，更有利于菌體在高酸的環(huán)境下生長(zhǎng)代謝[15,19]。由此也可以證實(shí)，當(dāng)將酸敏菌株暴露于酸性環(huán)境中，其胞內(nèi)的酸堿平衡瞬間被打破，且其調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生境pH值平衡的能力差，因而得不到很好的修復(fù)，使得胞內(nèi)參與各個(gè)代謝通路的酶活性受到抑制，直接導(dǎo)致胞內(nèi)的各個(gè)代謝通路停滯，細(xì)胞更加不能正常代謝生長(zhǎng)[22]，相應(yīng)的生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶效率也不高。

2.4 β-葡萄糖苷酶基因檢測(cè)

2.4.1 β-葡萄糖苷酶目的基因PCR擴(kuò)增

圖2 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR-amplified products

13 株菌株β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖2所示。所有菌株都得到了1 400 bp左右大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.4.2 β-葡萄糖苷酶基因序列分析

為排除誘變可能引發(fā)菌株β-葡萄糖苷酶基因的改變，從而導(dǎo)致其β-葡萄糖苷酶活性發(fā)生變化可能性。篩選3 組耐酸脅迫能力差異大且酶活性差異大的菌株（耐酸突變株a3、c1、b1，以及對(duì)應(yīng)的酸敏突變株a1-1、c2-1、b2，出發(fā)菌株SX-1a、SX-1b），對(duì)其β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行分析。測(cè)序結(jié)果提交GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，菌株SX-1a、SX-1b、a1-1、a3、c2-1、c1、b1、b2的β-葡萄糖苷酶基因訪問(wèn)號(hào)依次為KU594295、KU594296、KU594297、KU594298、KU594299、KU594300、KU594301、KU594302。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，8 株測(cè)定序列與GenBank中已發(fā)表的酒酒球菌β-糖苷酶基因序列（GenBank：AY489108.1）同源性高達(dá)99%。

此外，除菌株a3的糖苷酶基因序列在108位（G置換成C）和1 232位（A置換成T）堿基處發(fā)生了改變，翻譯成蛋白質(zhì)序列的比對(duì)結(jié)果顯示，a3菌株對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列僅在411位處發(fā)生了改變，由酪氨酸（Y）突變成了苯丙氨酸（F）。其余7 株菌的β-葡萄糖苷酶基因序列一致。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，β-葡萄糖苷酶基因不是造成耐酸突變株與酸敏突變株之間酶活性差異的原因。

2.5 相關(guān)性分析

表5 酒酒球菌pH 3.0累積生物量和β-葡萄糖苷酶活性的相關(guān)性分析Table5 Correlation analysis between O. oeennii maximum biomass at pH 3.0 anndd β-glycosidase activviittyy

分別對(duì)酒酒球菌SX-1a及其突變株（第1組）、SX-1b及其突變株（第2組）、CS-1b及其突變株（第3組），pH 3.0累積最大生物量（穩(wěn)定期的A600nm）與β-葡萄糖苷酶平均酶活進(jìn)行相關(guān)性分析。從表5可知，酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與菌株自身耐酸脅迫能力顯著相關(guān)。

3 討 論

為了挖掘酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活力與其耐酸脅迫能力之間的關(guān)聯(lián)性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)合利用離子注入誘變和脅迫培養(yǎng)的方式，獲得了耐酸性狀能夠穩(wěn)定遺傳、pH 3.0低酸脅迫下生長(zhǎng)能力具有明顯差異的酒酒球菌耐酸和酸敏突變菌株，最大限度地避免菌株遺傳背景的差異，為酶活力與耐酸脅迫能力關(guān)聯(lián)性提供可靠的佐證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終證實(shí)，酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活力與其耐酸脅迫能力相關(guān)。且實(shí)驗(yàn)篩選獲得的耐酸、酸敏酒酒球菌為研究酒酒球菌酸脅迫調(diào)控基因提供了優(yōu)良菌株資源。β-葡萄糖苷酶活力數(shù)據(jù)以及糖苷酶基因測(cè)序結(jié)果顯示，耐酸突變株的β-葡萄糖苷酶活力遠(yuǎn)高于酸敏突變株，可能是參與調(diào)控細(xì)胞酸脅迫的某些生理機(jī)制也參與調(diào)控了菌株的β-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)有關(guān)，并且離子注入使得耐酸突變株中，更多同時(shí)參與調(diào)控耐酸脅迫機(jī)制和酶活力表達(dá)機(jī)制的基因被激活，表現(xiàn)出耐酸突變株更強(qiáng)耐酸能力、酶活力的提升，不過(guò)詳細(xì)的機(jī)理還需進(jìn)一步的研究。

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的活性還受到酒體其他因素的影響，如酒精、二氧化硫、糖含量等。因此，理論上認(rèn)為酒酒球菌耐酒精、二氧化硫等脅迫環(huán)境的能力與酶活力之間也存在著相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)的方法可為其他相關(guān)性研究提供參考。

本實(shí)驗(yàn)中篩選獲得的耐酸突變酒酒球菌，能夠在酸性環(huán)境下保持旺盛的活力和較高的β-葡萄酒苷酶的活性，可以適應(yīng)葡萄酒酒體的低酸環(huán)境，為低酸葡萄原料接種啟動(dòng)蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵提供了優(yōu)秀菌種資源。但是，耐酸突變酒酒球菌菌株否能夠順利啟動(dòng)蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，并且實(shí)現(xiàn)可靠且安全的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，提高葡萄酒感官質(zhì)量，這仍需要進(jìn)一步的研究。

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Correlation between β-Glycosidase Activity and Acid Stress Tolerance in Oenococcus oeni

CHEN Qiling1, REN Xiaoning1, WANG Ling1, TIAN Yu1, ZHAO Meijing1, SONG Qiaozhi1, LIU Shuwen1,2,3,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China; 3. Heyang Experimental Demonstration Station, Northwest A&F University, Yangling 715300, China)

Objective: β-Glycosidase plays a crucial role in the hydrolysis of aglycones and subsequent release of grapederived aroma compounds in wine. However, β-glycosidase activity is inf uenced by many factors. This study was designed taking into account the acid tolerance of Oenococcus oeni to assess and correlate their glucosidase activities with acid stress tolerance. Methods: The cells of O. oeni were implanted with N＋ion to obtain acid-tolerant (pH 3.0) and acid-sensitive (pH 9.0) mutants. Besides, β-glycosidase activities of all the tested strains were determined. Three groups of variant O. oeni were selected and their β-glycosidase genes were sequenced. Results: The acid-tolerant mutants harbored a signif cantly increased β-glucosidase activity that was 2-4 times higher than that of the original strains, and 2-7 times higher than that of the corresponding acid-sensitive mutants. Sequencing results of eight representative amplicons indicated that all the mutants and their parental strains were identical to each other, except a3 mutant, which formed two base transversions at 108 gene locus (G→C) and at 1 232 locus (A→T). Conclusion: Correlation analysis indicated that O. oeni β-glycosidase activity was signif cantly positively related to acid stress resistance (P ＜ 0.05).

Oenococcus oeni; ion implantation; acid tolerance; β-glucosidase; correlation analysis

10.7506/spkx1002-6630-201702019

Q815

A

1002-6630（2017）02-0115-06

陳其玲, 任曉寧, 王玲, 等. 酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與耐酸脅迫能力的相關(guān)性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 115-120. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702019. http://www.spkx.net.cn

CHEN Qiling, REN Xiaoning, WANG Ling, et al. Correlation between β-glycosidase activity and acid stress tolerance in Oenococcus oeni[J]. Food Science, 2017, 38(2): 115-120. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702019. http://www.spkx.net.cn

2016-03-11

陳其玲（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)獒劸莆⑸铩-mail：fjgcql@sina.com

*通信作者：劉樹(shù)文（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)獒劸莆⑸?。E-mail：liushuwen@nwsuaf.edu.cn