李玉山，楊夕陽，侯方圓，王全先，劉軍杰，王琳凱，蘇彥華，孫 琳

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院人類精子庫 鄭州 450052

特發(fā)性弱精子癥患者精子中SEPT7的表達(dá)*

李玉山△，楊夕陽，侯方圓，王全先，劉軍杰，王琳凱，蘇彥華，孫 琳

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院人類精子庫 鄭州 450052

△男，1966年1月生，碩士，教授，研究方向:生殖免疫學(xué)，E-mail：liyushanrun@126.com

SEPT7；特發(fā)性弱精子癥

目的：檢測特發(fā)性弱精子癥患者精子中SEPT7的表達(dá)。方法：正常對照組30例，特發(fā)性弱精子癥組30例(弱精子癥組)，采用密度梯度離心法收集精子，分別采用RT-PCR和Western blot檢測精子中SEPT7 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與正常對照組相比，弱精子癥組精子中SEPT7 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均降低(P均<0.001)。結(jié)論：SEPT7的表達(dá)水平降低可能影響精子活力。

弱精子癥是目前影響男性生育能力的主要原因之一。引起弱精子癥的因素很多，其中精索靜脈曲張、感染、免疫因素等都會引起精子的活動力降低，但是約有75%的不育患者病因不明，屬于特發(fā)性弱精子癥[1]。目前研究表明與弱精子癥發(fā)病相關(guān)的基因家族有很多，如Catsper[2]、Septin[3]、Tektins[4]家族，其中Septin家族是具有GTP酶活性、高度保守的基因家族，SEPT7是其家族成員之一[5-6]。SEPT7位于人類常染色體7p14.3，它對脊柱形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)元樹突發(fā)展至關(guān)重要，同時也是人類和小鼠精子環(huán)結(jié)構(gòu)成分之一[7]，對精子的正常形態(tài)和活力起著至關(guān)重要的作用。該研究檢測了特發(fā)性弱精子癥患者精子中SEPT7蛋白和mRNA的表達(dá)水平，為特發(fā)性弱精子癥的診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人SEPT7多克隆抗體、兔抗人GAPDH抗體(美國Abcam公司)，總蛋白提取試劑盒、BCA測定試劑盒、Marker、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，NC膜(美國Millipore公司)，Trizol試劑(美國Ambion公司)，RT-PCR試劑盒(日本TOYOBO公司)，電泳儀(DYY-6D，北京六一儀器廠)，轉(zhuǎn)膜儀(JY300C，北京君意儀器公司)，Odyssey CLx掃描分析儀(美國LICOR公司)，RT-PCR儀(7500 Real Time PCR，美國Applied Biosystems公司)。

1.2 標(biāo)本取材與處理 選取2015年9～12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院男科門診就診并確診為特發(fā)性弱精子癥的患者30例(弱精子癥組)，禁欲2～7 d，采用手淫法收集精液至無菌杯中，37 ℃孵育，60 min內(nèi)液化完全。正常對照來自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院河南省人類精子庫的30名供精者的合格標(biāo)本。2組均排除液化時間、pH、精液量、感染、精索靜脈曲張、免疫及激素水平異常的精液標(biāo)本，2組間年齡、精液量、pH等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。采用非連續(xù)密度梯度離心法從完全液化的精液標(biāo)本中收集精子。調(diào)整為60×106mL-1，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

表1 2組精液基本參數(shù)分析

1.3 2組精子中SEPT7 mRNA表達(dá)的檢測 按照Trizol試劑說明書提取RNA，取10 μL RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增引物由北京鼎國公司設(shè)計和合成。SEPT7上游引物序列5’-CAAAGCAGACACACT CACAC-3’，下游引物序列5’-TTCAGCAACAC CCCAAGGAT-3’,產(chǎn)物大小238 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物序列5’-CAAAGTTGTCATGGATGGACC-3’，產(chǎn)物長度500 bp。PCR反應(yīng)體系20 μL：無酶水 6.4 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，樣品溶液2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃15 s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，圖像掃描儀掃描，用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨立樣本t檢驗比較2組精子中SEPT7 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2組精子中SEPT7 mRNA和蛋白的表達(dá)水平見圖1、2，表2。

1～3:正常對照組；4～6:弱精子癥組。圖1 SEPT7 mRNA的RT-PCR檢測

1～3:正常對照組；4～6:弱精子癥組。圖2 SEPT7蛋白的Western blot檢測

組別nmRNA蛋白正常對照組300．81±0．080．79±0．09弱精子癥組300．52±0．060．47±0．11t14．93011．841P<0．001<0．001

3 討論

Septin最初發(fā)現(xiàn)于酵母中，是酵母芽頸的主要結(jié)構(gòu)成分;由于成員中任意一個表達(dá)缺失均可導(dǎo)致酵母細(xì)胞周期的停滯和出芽生長的缺陷，即與母細(xì)胞和芽孢的分離相關(guān)，故命名為Septin[9]。目前，在人類基因水平已知Septin基因家族有14個成員，并在胚胎發(fā)育中起著重要作用[10]。大多數(shù)成員都包含位于中央?yún)^(qū)域高度保守的環(huán)狀GTP結(jié)合域、可變異剪接的N端和特異的C端卷曲結(jié)構(gòu)域，由于轉(zhuǎn)錄過程包含多個翻譯起始點和變異剪接，從而產(chǎn)生多個Septin亞型[10-11]。

Septin形成同質(zhì)和異質(zhì)型復(fù)合物組裝成絲狀結(jié)構(gòu)。Septin亞型之間的結(jié)構(gòu)具有相似性，特別是SEPT4、SEPT7、SEPT12之間具有高度相似性，可能共同參與精子亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成。精子形成過程中SEPT7、SEPT12調(diào)節(jié)4個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成(即頂體、頭部、中段、尾部)，SEPT7還可能參與精子環(huán)的形成[12]。

精子的成熟涉及剩余胞質(zhì)去除、細(xì)胞質(zhì)膜重塑、染色質(zhì)濃縮、尾芽和頂體的形成[13]。精子活力差、透明帶穿透能力低下、非整倍體增加、核DNA損傷都能導(dǎo)致精子活力低下[14]。該研究結(jié)果顯示，特發(fā)性弱精子癥患者精子中SEPT7的表達(dá)水平顯著降低，考慮到SEPT4基因敲除小鼠也表現(xiàn)出不成熟的精子比率增加[15]，推測SEPT4/7可能共同參與調(diào)節(jié)精子成熟，影響精子活力。Septin環(huán)通過在精子中段-主段連接處形成物理屏障，維持精子中段和主段信號物質(zhì)及其他蛋白的不對稱分布，與酵母細(xì)胞有絲分裂過程中Septin環(huán)維持細(xì)胞極性功能非常相似[16]。在精子形成過程中，線粒體經(jīng)過劇烈調(diào)整形成螺旋排列的線粒體鞘，SEPT7表達(dá)降低可能引起線粒體鞘的異常和缺失，從而影響精子活力。

總之，SEPT7在精子中表達(dá)下降會影響精子活力，SEPT7可作為弱精子癥發(fā)病機制研究的一個重要靶點。研究Septin家族在正常精子和弱精子癥患者精子中的表達(dá)也可為分子避孕提供新的途徑。但其上游調(diào)控機制和各個亞型之間如何形成復(fù)合物，以及復(fù)合物之間的關(guān)系還需要更深入的探索。

[1]LIU B,WANG P,WANG Z,et al.Analysis and difference of voltage-dependent anion channel mRNA in ejaculated spermatozoa from normozoospermic fertile donors and infertile patients with idiopathic asthenozoospermia[J].J Assist Reprod Genet,2010,27(12):719

[2]周俊豪.CRISP2蛋白在弱精癥精液精子中表達(dá)下調(diào)的分子機制及其臨床意義[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2015.

[3]CHAO HC,LIN YH,KUO YC,et al.The expression pattern of SEPT7 correlates with sperm morphology[J].J Assist Reprod Genet,2010,27(6):299

[4]李玉山,陳河濤,楊夕陽,等.TEKT3在特發(fā)性弱精子癥患者精子中的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2015,50(6):843

[5]BANSAL SK,GUPTA N,SANKHWAR SN,et al.Differential genes expression between fertile and infertile spermatozoa revealed by transcriptome analysis[J].PLoS One,2015,10(5):e0127007

[6]NAGATA K,ASANO T,NOZAWA Y,et al.Biochemical and cell biological analyses of a mammalian septin complex, Sept7/9b/11[J].J Biol Chem,2004,279(53):55895

[7]IHARA M,KINOSHITA A,YAMADA S,et al.Cortical organization by the septin cytoskeleton is essential for structural and mechanical integrity of mammalian spermatozoa[J].Dev Cell,2005,8(3):343

[8]李玉山,吉曉菲,王全先,等. 特發(fā)性弱精子癥患者精子中TCTE3的表達(dá)[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2014,49(1):83

[9]HALL PA,RUSSELL SE.The pathobiology of the septin gene family[J].J Pathol,2004,204(4):489

[10]TAKIZAWA PA,DERISI JL,WILHELM JE,et al.Plasma membrane compartmentalization in yeast by messenger RNA transport and a septin diffusion barrier[J].Science,2000,290(5490):341

[11]李玉山,馮曉霞,吉曉菲,等.SEPT4蛋白在特發(fā)性弱精子癥患者精子中的表達(dá)[J].中華男科學(xué)雜志,2011，17(8):699

[12]LHUILLIER P,RODE B,ESCALIER D,et al.Absence of annulus in human asthenozoospermia: case report[J].Hum Reprod,2009,24(6):1296

[13]LIN YH,LIN YM,WANG YY,et al.The expression level of septin12 is critical for spermiogenesis[J].Am J Pathol,2009,174(5):1857

[14]GREGORY M,CYR DG.The blood-epididymis barrier and inflammation[J].Spermatogenesis,2014,4(2):e979619

[15]COOPER TG.Cytoplasmic droplets:the good,the bad or just confusing?[J].Human Reproduction,2004,20(1):9

[16]KISSEL H,GEORGESCU MM,LARISCH S,et al.The Sept4 septin locus is required for sperm terminal differentiation in mice[J].Dev Cell,2005,8(3):353

(2016-04-08收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Expression of SEPT7 in sperms from patients with idiopathic asthenozoospermia

LIYushan,YANGXiyang,HOUFangyuan,WANGQuanxian,LIUJunjie,WANGLinkai,SUYanhua,SUNLin

HumanSpermBank，theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

SEPT7;idiopathic asthenozoospermia

Aim: To investigate the expression of SEPT7 in sperms from patients with idiopathic asthenozoospermia.Methods: Thirty patients with idiopathic asthenozoospermia and 30 normal controls were collected.The sperm were collected by density gradient centrifugation, and the expression levels of SEPT7 mRNA and protein were determined by RT-PCR and Western blot,respectively.Results: The expression levels of SEPT7 mRNA and protein in idiopathic asthenozoospermia group were obviously lower than those of normal control group(P<0.001). Conclusion: The decreased expression of SEPT7 may affect sperm motility.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.013

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項目 201503116

R698.2