陶文惠 王 帆 林 雪 馬敏星 趙 秋 李 瑾

武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科 湖北省腸病醫(yī)學(xué)臨床研究中心/腸病湖北省重點實驗室(430071)

·論 著·

潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病、疾病活動和生物治療療效相關(guān)基因CRELD2的生物信息學(xué)分析*

陶文惠 王 帆 林 雪 馬敏星 趙 秋 李 瑾#

武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科 湖北省腸病醫(yī)學(xué)臨床研究中心/腸病湖北省重點實驗室(430071)

背景：應(yīng)用生物信息學(xué)方法能有效挖掘基因芯片數(shù)據(jù)，并對單基因功能進行預(yù)測分析。目的：對與潰瘍性結(jié)腸炎(UC)發(fā)病、疾病活動和生物治療療效相關(guān)的CRELD2基因進行生物信息學(xué)分析，為深入研究該基因的生物學(xué)功能及其參與UC發(fā)生、發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)。方法：從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO數(shù)據(jù)庫)中下載UC發(fā)病、疾病活動和生物治療療效相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用BRB-ArrayTools、ProtParam、ELM、SignalP 4.1、PBIL-IBCP Lyon Gerland、GO、STRING等生物信息學(xué)工具進行數(shù)據(jù)挖掘和分析。結(jié)果：交叉分析顯示，在UC發(fā)病、疾病活動中進行性表達增高，同時在英夫利昔單抗治療有效后表達明顯降低的基因共有4個，分別為CDC25B、CRELD2、IL1RN、PITPNC1，其中CRELD2基因功能未知。生物信息學(xué)分析顯示，人CRELD2基因位于染色體22q13.33，編碼由402個氨基酸殘基組成的分泌型蛋白。CRELD2蛋白含有多個表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域，主要分布于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞外，主要參與鈣離子結(jié)合和蛋白結(jié)合，與CHRNA4、CHRNB2、RHBDD3等蛋白之間存在相互作用。結(jié)論：CRELD2可能具有類似EGF的功能，并可能通過直接或間接參與免疫細胞的調(diào)控對UC發(fā)病、疾病活動產(chǎn)生影響，有望成為UC診斷、疾病活動性評估、療效評估的新指標和新的治療靶點。

CRELD2基因； 結(jié)腸炎，潰瘍性； 生物信息學(xué)； 微陣列分析

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要癥狀為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急后重感。5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑是UC的主要治療藥物，但長期使用需關(guān)注藥物不良反應(yīng)，且部分患者療效欠佳[1]。近年來，隨著英夫利昔單抗(infliximab, IFX)、阿達木單抗(adalimumab)等腫瘤壞死因子抗體類生物制劑的應(yīng)用，UC治療的臨床療效明顯改善。

UC的發(fā)病機制目前仍不清楚，可能是遺傳易感人群中環(huán)境因素、微生物因素和腸道免疫系統(tǒng)間相互作用的結(jié)果，體內(nèi)多種免疫相關(guān)基因異常參與了這一過程。尋找與UC發(fā)病、疾病活動和生物治療療效均相關(guān)的基因，對揭示UC發(fā)病機制以及尋找新的藥物治療靶點具有重要意義。基因芯片作為一種高效、大規(guī)模獲取生物學(xué)信息的技術(shù)，能鑒別不同組織間的差異表達基因[2]。生物信息學(xué)(bioinformatics)是在生命科學(xué)研究中，以計算機為工具對生物學(xué)信息進行儲存、檢索和分析的科學(xué)。應(yīng)用生物信息學(xué)方法能有效挖掘基因芯片數(shù)據(jù)，獲取生物內(nèi)在信息，并對單基因功能進行預(yù)測分析。本研究利用基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, GEO數(shù)據(jù)庫)中的基因芯片原始數(shù)據(jù)進行差異表達基因分析，獲取同時與UC發(fā)病、疾病活動和生物治療療效相關(guān)的共性基因，并對其中功能未知的基因CRELD2進行初步生物信息學(xué)分析，以期為深入研究該基因的生物學(xué)功能及其參與UC發(fā)生、發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、主要資料

正常人、UC患者、UC患者IFX治療前后的結(jié)腸黏膜表達譜芯片數(shù)據(jù)來源于NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)，登錄號為GSE38713和GSE16879，分別由Planell等和Arijs等提交。GSE38713中包括13例正常人結(jié)腸黏膜、15例活動期UC炎癥腸黏膜和7例活動期UC正常腸黏膜；GSE16879中包括24例活動期UC IFX治療前后的腸黏膜，其中8例治療有效，16例治療無效。兩項研究中的結(jié)腸黏膜標本均于結(jié)腸鏡下取材，經(jīng)RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄、熒光標記等步驟處理后，與Affymetrix人類基因組U133 Plus 2.0芯片(GPL570芯片平臺)雜交，經(jīng)圖像掃描、數(shù)據(jù)標準化等處理后以CEL格式上傳至GEO數(shù)據(jù)庫。

二、方法

1. 數(shù)據(jù)過濾和標準化：從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE38713和GSE16879的原始數(shù)據(jù)。為使數(shù)據(jù)便于分析，同時獲得質(zhì)量高、表達信號強的基因，本研究采用justRMA算法對芯片數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，以中位數(shù)的方法對數(shù)據(jù)進行過濾和標準化?；蜻^濾要求：①兩組樣本的基因表達中位數(shù)發(fā)生2倍及以上變化，且20%及以上樣本可見此種變化；②基因表達數(shù)據(jù)缺失的樣本不超過50%。

2. 差異表達基因篩選：應(yīng)用BRB-ArrayTools軟件(https://brb.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools)[3]中的 Class Comparison工具，分別對GSE38713和GSE16879中的各組數(shù)據(jù)進行比較，IFX治療前后數(shù)據(jù)的比較采用配對t檢驗，其他組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.001判定為差異表達基因。最后以Excel軟件篩選出在UC發(fā)病、疾病活動中進行性表達增高(或降低)，同時在IFX治療有效后表達明顯降低(或增高)的基因，并對其中功能未知的基因進行初步生物信息學(xué)分析。

3. 基因定位和序列分析：在NCBI Gene數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中查找人CRELD2基因，獲得其基因組定位、基因序列、mRNA序列和編碼蛋白氨基酸序列。

4. 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)：應(yīng)用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析CRELD2基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量、理論等電點、疏水性等理化性質(zhì)。

5. 一級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析：應(yīng)用ELM工具(http://elm.eu.org/)預(yù)測CRELD2蛋白一級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域中的修飾位點和模體(蛋白質(zhì)中具有特定空間構(gòu)象和特定功能的二級結(jié)構(gòu))。

6. 信號肽、跨膜區(qū)域和磷酸化位點預(yù)測分析：應(yīng)用SignalP 4.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對CRELD2蛋白序列進行信號肽分析，應(yīng)用TMHMM 2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測蛋白跨膜區(qū)域，應(yīng)用NetPhos 2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測蛋白磷酸化位點。

7. 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析：應(yīng)用PBIL-IBCP Lyon Gerland信息庫中的HNN二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)對CRELD2蛋白序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

8. 基因本體和通路分析：應(yīng)用GO工具(Gene Ontology Consortium, http://www.geneontology.org/)對CRELD2基因進行分子功能、細胞內(nèi)定位和生物學(xué)過程分析，應(yīng)用KEGG工具(Kyoto Encyclo-pedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/)對其進行信號通路分析。

9. 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析：應(yīng)用STRING軟件(http://string-db.org/)對CRELD2蛋白進行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

結(jié) 果

一、差異表達基因篩選

經(jīng)數(shù)據(jù)過濾和標準化處理后，GSE38713和GSE16879中分別有2 012個和2 134個基因通過過濾標準。剔除重復(fù)和非特異性探針后發(fā)現(xiàn)，與正常人結(jié)腸黏膜相比，活動期UC炎癥腸黏膜中有860個差異表達基因(563個上調(diào)，297個下調(diào))，活動期UC正常腸黏膜中有103個差異表達基因(32個上調(diào)，71個下調(diào))?；顒悠赨C炎癥腸黏膜與正常腸黏膜的比較顯示，614個基因表達存在差異，其中炎癥部位498個基因表達上調(diào)，116個下調(diào)。IFX治療有效的活動期UC，治療后57個基因表達上調(diào)，176個下調(diào)；與IFX治療無效者相比，治療有效者77個基因表達上調(diào)，155個下調(diào)。交叉分析顯示，在UC發(fā)病、疾病活動中進行性表達增高，同時在IFX治療有 效后表達明顯降低的基因共有4個，分別為CDC25B、CRELD2、IL1RN、PITPNC1(表1)。其中CDC25B、IL1RN、PITPNC1基因功能及其與UC的關(guān)系已比較明確，CRELD2基因功能則未知，與UC的關(guān)系亦不明，故進一步對該基因進行生物信息學(xué)分析。

表1 正常人和不同組別UC患者間顯著差異表達基因*

*只列出上調(diào)或下調(diào)幅度最大的前15個基因和4個共表達基因

二、基因定位和序列分析

人CRELD2基因位于染色體22q13.33，全長9 374 bp，可轉(zhuǎn)錄為4個mRNA(NM_001135101.2、NM_001284317.1、NM_001284318.1、NM_024324.4)，分別對應(yīng)4個編碼蛋白(NP_001128753.1、NP_001271246.1、NP_001271247.1、NP_077300.3)，其中NM_001135101.2長1 596 bp，有11個外顯子和10個內(nèi)含子，編碼含402個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)NP_001128753.1。

三、基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

CRELD2蛋白由402個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為43 578.7 Da(1 Da=0.992 1 u)，理論等電點為pH 4.71，半衰期在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞中為30 h；不穩(wěn)定指數(shù)為48.98(>40考慮不穩(wěn)定)，分類為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪系數(shù)為55.85，平均疏水值為-0.450，為親水性蛋白質(zhì)。

四、一級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

CRELD2蛋白一級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域中包含多個酶切位點(CLV)、配體位點(LIG)和蛋白修飾位點(MOD)。該蛋白包含6個重要結(jié)構(gòu)域，分別為1個表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域(EGF-like domain)、2個 富含半胱氨酸的Furin樣重復(fù)序列(Furin-like repeats)、2個EGF結(jié)構(gòu)域(EGF domain, unclassified subfamily)和1個鈣結(jié)合EGF樣結(jié)構(gòu)域(calcium-binding EGF-like domain)(圖1)。

五、信號肽、跨膜區(qū)域和磷酸化位點預(yù)測分析

CRELD2蛋白氨基酸序列中存在信號肽，為分泌型蛋白，剪切位點在第24～25 aa之間(圖2)；整條肽鏈均位于胞膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)；氨基酸序列包含24個可能的磷酸化位點，其中9個位于絲氨酸，10個位于蘇氨酸，5個位于酪氨酸。

六、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

CRELD2蛋白的拓撲結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測見圖4，大寫字母代表氨基酸，小寫字母代表預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)，α螺旋(h)、β折疊(e)、無規(guī)則卷曲(c)的比率分別為21.39%、11.44%和67.16%。

七、基因本體和通路分析

GO分析顯示CRELD2蛋白主要參與鈣離子結(jié)合和蛋白結(jié)合，主要分布于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞外，提示了其分泌型蛋白的特性；KEGG分析未發(fā)現(xiàn)其參與的信號通路。

圖1 CRELD2蛋白一級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖2 CRELD2蛋白信號肽預(yù)測

圖3 CRELD2蛋白跨膜預(yù)測

圖4 CRELD2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

八、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

CRELD2蛋白的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖5，該蛋白與TMEM50B、MANF、CHRNA4、GMPPB、CHRNB2、RHBDD3、ITFG1、PGAP2、ALG12、TMEM241蛋白之間存在相互作用。

圖5 CRELD2蛋白與其他蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，與UC發(fā)病、疾病活動和生物治療療 效均相關(guān)的基因共有4個，分別為CDC25B、CRELD2、IL1RN、PITPNC1，這些基因在UC發(fā)病、疾病活動中進行性表達增高，同時在IFX治療有效后表達明顯降低。為驗證這4個基因與UC疾病進程的相關(guān)性，本研究進一步分析了四者在IFX治療前后、治療有效與無效四組間的表達變化，結(jié)果顯示治療前、治療后無效三組間(均處于疾病活動期)四者表達無明顯變化，但與治療后有效組相比其表達均明顯增高，表明四者的表達變化與UC疾病活動性的相關(guān)性較高(圖6)。

CDC25B(cell division cycle 25B)在細胞有絲分裂中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其表達增高可促進腫瘤生長和細胞惡性轉(zhuǎn)化。CDC25B在多種惡性腫瘤中呈高表達，結(jié)直腸癌中其mRNA和蛋白高表達率分別為60%和43%[4]，但CDC25B基因與炎癥關(guān)系的報道尚少。持續(xù)炎癥刺激可導(dǎo)致UC癌變，因此推測結(jié)腸炎癥可能引起CDC25B表達增高。IL1RN(interleukin 1 receptor antagonist)基因主要編碼白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)。IL-1β是與UC發(fā)病、疾病活動密切相關(guān)的促炎細胞因子，而IL-1Ra對其具有抑制作用。研究[5]發(fā)現(xiàn)與正常人腸黏膜相比，UC患者腸黏膜IL-1α、IL-1β、IL-1Ra mRNA表達均顯著增高，提示IL1RN基因可能在UC中起重要調(diào)控作用。PITPNC1(phosphatidylinositol transfer protein, cytoplasmic 1)普遍存在于真核細胞內(nèi)，能結(jié)合并轉(zhuǎn)移磷脂酰肌醇和磷脂酸，對卵磷脂則無結(jié)合作用，結(jié)合有磷脂酸的PITPNC1可促進細胞膜組分間脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運[6]。由此認為PITPNC1可能通過影響腸黏膜脂質(zhì)代謝而在UC發(fā)病和疾病活動中發(fā)揮一定作用。

↓：表達明顯降低，P<0.001；(-)：表達無明顯變化

圖6 活動期UC IFX治療前后CDC25B、CRELD2、IL1RN、PITPNC1基因表達變化

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)折疊、修飾蛋白質(zhì)的重要細胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的未折疊蛋白反應(yīng)在IBD發(fā)病中發(fā)揮重要作用[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)CRELD2(cysteine-rich with EGF-like domains 2)基因表達，因此CRELD2基因可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)疾病如UC發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)過程。然而CRELD2基因的生物學(xué)功能及其在UC 發(fā)病、疾病活動中的作用機制均尚未明確。為此，本研究對CRELD2基因進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示人CRELD2基因位于染色體22q13.33，編碼由402個氨基酸殘基組成的親水性、分泌型蛋白。CRELD2蛋白含多個酶切位點、配體位點和蛋白修飾位點，且包含6個重要結(jié)構(gòu)域，主要分布于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞外。該蛋白功能活躍，主要參與鈣離子結(jié)合和蛋白結(jié)合，與TMEM50B、MANF、CHRNA4、GMPPB、CHRNB2、RHBDD3、ITFG1、PGAP2、ALG12、TMEM241蛋白之間存在相互作用。

EGF作為一種生長因子，可通過激活其受體(EGFR)而發(fā)揮促進細胞增殖、分化、存活和損傷愈合作用，局部給予EGF可促進損傷黏膜愈合[9]，誘導(dǎo)活動期UC緩解[10]。此外，EGF還可通過調(diào)節(jié)腸黏膜巨噬細胞的細胞因子產(chǎn)生發(fā)揮控制UC腸道炎癥的作用[11]。CRELD2蛋白含有多個EGF樣結(jié)構(gòu)域，因此可能具有類似EGF的功能。經(jīng)ToppGene工具(https://toppgene.cchmc.org/)分析后發(fā)現(xiàn)，CHRNA4、CHRNB2、RHBDD3基因與淋巴細胞激活和自然殺傷細胞抑制相關(guān)，而CRELD2蛋白與三者均存在相互作用，因此其間的相互作用可能影響淋巴細胞激活，CRELD2可能通過直接或間接參與免疫細胞的調(diào)控對UC發(fā)病、疾病活動產(chǎn)生影響。

本研究納入NCBI GEO數(shù)據(jù)庫中GSE38713和GSE16879兩項研究的結(jié)腸黏膜表達譜芯片原始數(shù)據(jù)進行分析，分析時采取分別在單個研究中篩選差異表達基因，再提取兩項研究共同差異表達基因的方法，避免了不同研究間芯片檢測的批次效應(yīng)。本研究首次發(fā)現(xiàn)了CRELD2基因與UC間的關(guān)系，因該基因功能未知，在UC中的作用機制亦不明，研究進一步對該基因進行生物信息學(xué)分析，為揭示UC發(fā)病機制提供了新思路，也為今后相關(guān)實驗研究提供了有價值的信息。本研究的局限性主要在于基于基因芯片數(shù)據(jù)的差異表達基因分析以及基于數(shù)據(jù)庫的單基因功能預(yù)測均偏于理論，需進一步應(yīng)用分子生物學(xué)方法進行驗證。

綜上所述，本研究通過分析基因芯片原始數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在UC發(fā)病、疾病活動中進行性表達增高，同時在IFX治療有效后表達明顯降低的4個基因CDC25B、CRELD2、IL1RN、PITPNC1，并對其中功能未知的CRELD2基因進行包括結(jié)構(gòu)、功能、蛋白間相 互作用等項目的生物信息學(xué)分析，結(jié)果提示CRELD2基因可能與UC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，有望成為UC診斷、疾病活動性評估、療效評估的新指標和新的治療靶點，值得進一步深入研究。

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(2016-05-20收稿；2016-06-01修回)

Bioinformatics Analyses of Gene CRELD2 that Associated with Pathogenesis, Disease Activity and Efficacy of Biological Agents in Ulcerative Colitis

TAOWenhui,WANGFan,LINXue,MAMinxing,ZHAOQiu,LIJin.

DepartmentofGastroenterology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity;HubeiClinicalCenter&KeyLabofIntestinalandColorectalDiseases,Wuhan(430071)

LI Jin, Email: 18207118835@163.com

CRELD2 Gene; Colitis, Ulcerative; Bioinformatics; Microarray Analysis

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.01.002

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81200283)

#本文通信作者，Email: 18207118835@163.com

Background: Bioinformatics is an effective technology for microarray data mining and gene function prediction. Aims: To analyze the gene CRELD2 that associated with pathogenesis, disease activity and efficacy of biological agents in ulcerative colitis (UC) by bioinformatics to provide a theoretical basis for subsequent studies on its biological function and molecular mechanism in the development and progress of UC. Methods: The microarray data associated with pathogenesis, disease activity and efficacy of biological agents in UC were downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO database); the data mining and analyses were conducted by using bioinformatics tools such as BRB-ArrayTools, ProtParam, ELM, SignalP 4.1, PBIL-IBCP Lyon Gerland, GO and STRING. Results: Cross-over analyses revealed that expressions of four genes (CDC25B, CRELD2, IL1RN, PITPNC1) were up-regulated in the order from colonic mucosa of healthy subjects, un-inflamed mucosa of active UC patients to inflamed mucosa of active UC patients, meanwhile these four genes were significantly down-regulated in infliximab responders after treatment when compared with that before treatment and infliximab non-responders. The function of CRELD2 gene was unknown. Bioinformatics analyses showed that CRELD2 gene was located on the long arm of chromosome 22 (22q13.33), and encoded a secreted protein composed of 402 amino acids. This protein contained several epidermal growth factor (EGF)-like domains, mainly distributed in Golgi apparatus, endoplasmic reticulum and extracellular site and had calcium- and protein-binding effect. Interactions existed between CRELD2 and CHRNA4, CHRNB2 and RHBDD3 proteins. Conclusions: Gene CRELD2 may have EGF-like biological function and via participating directly or indirectly the regulation of immunocytes to affect the pathogenesis and disease activity of UC. It might be used as a biomarker for diagnosis and assessment of disease activity and therapeutic efficacy of UC. Furthermore, it might be a potential target for treatment of UC.