林倩云 費(fèi)稼希 陳 燁

南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東省胃腸實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(510515)

艱難梭菌毒素致病基因調(diào)控機(jī)制和抗毒素治療

林倩云 費(fèi)稼希 陳 燁*

南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東省胃腸實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(510515)

艱難梭菌(C.difficile)是一種重要的院內(nèi)感染病原體，是抗菌藥物相關(guān)性腹瀉的主要致病菌。C.difficile產(chǎn)毒菌株主要通過釋放腸毒素A(TcdA)和細(xì)胞毒素B(TcdB)引起結(jié)腸損傷和炎癥發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)C.difficile相關(guān)性疾病(CDAD)的嚴(yán)重程度與宿主體內(nèi)細(xì)菌毒素水平相關(guān)。然而，不同菌株產(chǎn)毒能力差異較大，與毒素產(chǎn)生過程中涉及的基因調(diào)控密切相關(guān)。本文就C.difficile毒素致病基因調(diào)控機(jī)制和抗毒素治療作一綜述。

難辨梭菌； 細(xì)菌毒素類； 基因調(diào)控； 治療

艱難梭菌(Clostridiumdifficile,C.difficile)為革蘭陽(yáng)性專性厭氧梭狀芽孢桿菌，是一種重要的院內(nèi)感染病原體，是抗菌藥物相關(guān)性腹瀉的主要致病菌。正常腸道菌群可有效抑制C.difficile的定植和繁殖?？咕幬?、化療藥物等因素可破壞腸道菌群平衡，導(dǎo)致該菌種過度生長(zhǎng)，釋放腸毒素A(TcdA)和細(xì)胞毒素B(TcdB)引起結(jié)腸損傷和炎癥發(fā)生。C.difficile相關(guān)性疾病(CDAD)的嚴(yán)重程度可為自輕微自限性腹瀉到膿毒性休克、多器官衰竭，即使給予萬古霉素、甲硝唑治療，死亡率仍有7%，且發(fā)病率和死亡率呈逐年增加趨勢(shì)[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)CDAD的嚴(yán)重程度與宿主體內(nèi)細(xì)菌毒素水平相關(guān)。然而，不同菌株產(chǎn)毒能力差異較大，與毒素產(chǎn)生過程中涉及的基因調(diào)控密切相關(guān)。目前C.difficile感染過程中的致病和毒素調(diào)控機(jī)制仍未完全明確，重癥或反復(fù)發(fā)作性患者缺乏確切有效的治療措施。本文就C.difficile毒素致病基因調(diào)控機(jī)制和抗毒素治療作一綜述。

一、TcdA和TcdB

1. 功能區(qū)域：C.difficile的致病性主要依賴于兩種致瀉毒素，即TcdA[2710 aa, 308 kDa(1 Da=0.992 1 u)]和TcdB(2366 aa, 270 kDa)[4]。迄今為止發(fā)現(xiàn)的所有產(chǎn)毒菌株均可合成TcdB，而TcdA編碼序列C端的重復(fù)寡肽序列常發(fā)生片段缺失，導(dǎo)致TcdA不能正常合成[5]。目前除TcdA+B+、TcdA-B+菌株外，還發(fā)現(xiàn)了TcdA+B-C.difficile變異菌株，但尚無相關(guān)流行病學(xué)資料[6]。TcdA和TcdB隸屬大分子梭菌屬糖基化單鏈蛋白質(zhì)[7]，兩者49%的氨基酸序列一致[8]，63%的氨基酸序列相似[8-9]，包括至少4個(gè)關(guān)鍵區(qū)域[10-12]：N末端的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域(GTD)；半胱氨酸蛋白酶區(qū)域(CPD)；轉(zhuǎn)運(yùn)功能區(qū)(TD)，包括孔道形成蛋白和疏水區(qū)域；以及肽鏈C端可結(jié)合的重復(fù)寡肽序列(CROPs)構(gòu)成的受體結(jié)合區(qū)域(RBD)。對(duì)以上4個(gè)蛋白片段構(gòu)建失活突變以及缺失功能學(xué)研究[8]發(fā)現(xiàn)，具有酶活性的GTD片段和可形成孔道的TD片段是毒素發(fā)揮毒性的必須成分，而CPD和C末端的CROPs為非必須成分，失活或缺失該區(qū)域菌株的毒力僅較野生型菌株低10～100倍。

2. 入胞和致病機(jī)制：TcdA/B的內(nèi)吞攝取作用為網(wǎng)格蛋白依賴性，兩種毒素通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用形成核內(nèi)體，空泡型ATP酶(V-ATpase)可誘導(dǎo)核內(nèi)體酸度增加[13]，酸性環(huán)境誘發(fā)毒素蛋白構(gòu)象變化，毒素TD疏水片段插入核內(nèi)體膜形成跨膜孔隙，導(dǎo)致GTD和CPD片段進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[10,12]。在細(xì)胞質(zhì)中，宿主六磷酸肌醇(IP6)變構(gòu)激活CPD結(jié)構(gòu)域，毒素自催化分解釋放可發(fā)揮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的GTD片段，其可特異性修飾和失活結(jié)合于蘇氨酸殘基上的Rho家族小G蛋白，包括Rho、Rac以及Cdc42[14]，引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)受損，進(jìn)而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白解聚和細(xì)胞壞死，觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，破壞細(xì)胞間緊密連接，使腸道黏膜通透性增加，導(dǎo)致組織損傷、腹瀉以及偽膜性結(jié)腸炎[4,15]。盡管TcdA與TcdB的蛋白結(jié)構(gòu)和IP6介導(dǎo)的激活機(jī)制相似，但TcdB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的毒性至少為TcdA的100倍[8]，兩者自催化分解的效率差異較大，Zhang等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，TcdA的CROPs片段可阻礙IP6介導(dǎo)的CPD激活，此可能造成TcdA毒力較低，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

近年研究[12,17]發(fā)現(xiàn)，TcdB蛋白aa 1106位點(diǎn)位于TD疏水域的亮氨酸殘基對(duì)毒素在核內(nèi)體膜上形成孔道的能力有決定性作用，此進(jìn)一步解釋了TcdB的入胞機(jī)制，但該作用尚未在TcdA中得到驗(yàn)證。一般認(rèn)為TcdA/B需通過CROPs與受體細(xì)胞結(jié)合發(fā)揮毒性作用，但研究[11,18]發(fā)現(xiàn)完全缺失CROPs片段的毒素蛋白在高濃度情況下仍可表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，提示存在其他受體結(jié)合位點(diǎn)或內(nèi)吞途徑。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，TcdB的細(xì)胞受體硫酸軟骨素蛋白多糖4(CSPG4)、脊髓灰質(zhì)炎病毒樣受體3(PVRL3)與TcdB的結(jié)合位點(diǎn)均在CROPs片段之外。Manse等[11]的研究亦進(jìn)一步證實(shí)了TcdB除CROPs片段(1851～2366)外，亦存在兩個(gè)片段aa(1372～1493)、aa(1493～1848)可獨(dú)立地與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合并介導(dǎo)TcdB入胞。

二、C. difficile致病基因座(pathogenicity locus, PaLoc)

C.difficile的PaLoc存在于所有產(chǎn)毒菌株中，長(zhǎng)度約為19.6 kb，PaLoc區(qū)域包括毒力編碼基因tcdA、tcdB、tcdR、tcdC以及tcdE 5個(gè)基因[19]。以往研究認(rèn)為PaLoc在染色體上的位置固定，然而Monot等[6]通過對(duì)3株C.difficile非典型菌株行基因組分析發(fā)現(xiàn)，PaLoc可位于不同基因位點(diǎn)，并提出PaLoc進(jìn)化的新模式：由2個(gè)單毒素PaLoc(mono-toxin PaLoc)進(jìn)化融合為1個(gè)二元毒素PaLoc(bi-toxin PaLoc)。PaLoc能從產(chǎn)毒菌株轉(zhuǎn)移至非產(chǎn)毒菌株，常與接合轉(zhuǎn)座子(conjugative transposons, CTn)協(xié)同轉(zhuǎn)移[20-21]。PaLoc區(qū)域的基因水平轉(zhuǎn)移以及基因重組是導(dǎo)致毒素多樣性的主要機(jī)制[6]。

大多數(shù)非產(chǎn)毒菌株中PaLoc缺失，其位點(diǎn)被115 bp/75 bp非編碼的高度保守序列取代[5,22]，因而普遍認(rèn)為非產(chǎn)毒菌株不具有致病性。研究[23]表明，非產(chǎn)毒C.difficile或其孢子可治愈復(fù)發(fā)性C.difficile感染，并抑制產(chǎn)毒菌株在腸道內(nèi)定植。進(jìn)一步通過基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，非產(chǎn)毒菌株的基因表達(dá)譜與產(chǎn)毒菌株類似[22]。非產(chǎn)毒株可通過水平轉(zhuǎn)移獲得PaLoc，使其毒素水平與產(chǎn)毒菌株無顯著差異[21]，因此明確非產(chǎn)毒株在何種條件下可獲得PaLoc，以及具備何種特征的非產(chǎn)毒株易獲得PaLoc對(duì)評(píng)估其安全性至關(guān)重要。

1. tcdA和tcdB基因：tcdA和tcdB在tcdR、tcdC以及tcdE等基因調(diào)控下分泌TcdA和TcdB蛋白。tcdA、tcdB以及tcdR在細(xì)菌靜止期轉(zhuǎn)錄，而tcdC轉(zhuǎn)錄發(fā)生于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[24]，轉(zhuǎn)錄時(shí)間上的差異提示在轉(zhuǎn)錄水平上，tcdR可能對(duì)tcdA、tcdB表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)作用，而tcdC可能發(fā)揮抑制作用。目前關(guān)于tcdE的調(diào)控作用尚存在爭(zhēng)議，李先平等[25]的研究表明，tcdE與tcdA和tcdB的轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)，提示tcdE對(duì)tcdA、tcdB發(fā)揮正調(diào)控功能。

2. tcdR基因：tcdR編碼約22 kDa的堿性蛋白TcdR，其功能為RNA聚合酶的σ亞基，可激活tcdA、tcdB及其本身轉(zhuǎn)錄。在其他致病性梭狀芽孢桿菌(肉毒桿菌、破傷風(fēng)桿菌以及產(chǎn)氣莢膜菌等)中亦發(fā)現(xiàn)了功能與TcdR功能類似的激活毒素基因表達(dá)的蛋白。tcdR及其毒素表達(dá)受細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)條件、生長(zhǎng)溫度以及生長(zhǎng)階段等因素影響。因此，如何在不同條件下有效激活tcdR表達(dá)，可能成為誘導(dǎo)毒素基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵。

3. tcdC基因：tcdC編碼約26 kDa的酸性胞膜蛋白TcdC，通過干擾已結(jié)合TcdR的RNA聚合酶識(shí)別tcdA、tcdB啟動(dòng)子，從而抑制毒素基因表達(dá)[19,24]。游離TcdR和與RNA聚合酶結(jié)合的TcdR均對(duì)TcdC敏感。然而一旦與tcdA啟動(dòng)子結(jié)合的開放性轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形成，TcdC即失去干擾能力，表明TcdC僅在轉(zhuǎn)錄起始階段對(duì)σ因子而非RNA聚合酶核心酶起作用。

4. tcdE基因：tcdE編碼高度疏水蛋白TcdE。Govind等[26]從一級(jí)結(jié)構(gòu)特征及其序列的相似性推測(cè)TcdE隸屬于穴蛋白classⅠ 家族，其功能可能與該家族中λ 噬菌體產(chǎn)生的具有裂解細(xì)菌作用的S蛋白類似，認(rèn)為與毒素的外分泌有關(guān)。然而研究[27]發(fā)現(xiàn)，在C.difficile標(biāo)準(zhǔn)菌株VPI0463中，tcdE失活并不影響毒素釋放和分泌。tcdE編碼序列上存在3個(gè)潛在起始密碼子(AUG)，分別自位點(diǎn)1(Met1)、25(Met25)以及27(Met27)翻譯成TcdE166、TcdE142以及TcdE140三種蛋白亞型。Govind等[28]的研究證實(shí)了TcdE對(duì)高毒力菌株(027型)分泌TcdA、TcdB的必要性，并且發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TcdE166和TcdE142可導(dǎo)致菌體死亡，而TcdE140對(duì)菌體存活幾乎無影響，然而自然狀態(tài)下TcdE介導(dǎo)的毒素分泌并未伴隨細(xì)菌裂解或裂解的菌體極少，可能由于菌體調(diào)控了TcdE三種蛋白亞型的表達(dá)比例。如何激活tcdE轉(zhuǎn)錄及其三種蛋白亞型的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

三、二元毒素及其基因調(diào)控

包括NAPI/027型在內(nèi)的約17%～23%的C.difficile產(chǎn)毒株可分泌C.difficile二元毒素(C.difficilebinary toxin, CDT)[6]。CDT包括兩個(gè)獨(dú)立的蛋白亞基，即具有酶活性的CDTa和具有結(jié)合能力的CDTb，分別由cdtA、cdtB基因編碼。Carter等[14]的研究表明，CDT的產(chǎn)生受LytTR家族反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CdtR調(diào)控。CdtR由位于cdtA/B上游的cdtR編碼，嚴(yán)格調(diào)控cdtA/B基因表達(dá)，該基因區(qū)域稱為CdtLoc。缺失完整cdtA/B基因或攜帶cdtA/B偽基因的菌株，其cdtR基因亦缺失，導(dǎo)致CdtLoc不完整或由一段68 bp的保守核苷酸序列取代。近年研究[6]發(fā)現(xiàn)，某些非典型菌株的CdtLoc序列與PaLoc連接，位于相同的基因組區(qū)域。

四、新治療途徑

2015年美國(guó)C.difficile感染臨床實(shí)踐指南[29]仍推薦使用萬古霉素、甲硝唑作為C.difficile感染的一線治療方案，然而抗菌藥物易進(jìn)一步破壞腸道微生態(tài)，加重菌群失衡，從而引起感染復(fù)發(fā)。因此有必要轉(zhuǎn)變治療模式，改變單純使用抗菌藥物作為一線治療的方案。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[30]證實(shí)不產(chǎn)毒菌株不引起任何疾病癥狀，因此研究多關(guān)注于中和毒素而非一味殺滅細(xì)菌。因毒素的作用位點(diǎn)在腸道，口服毒素中和制劑可在腸道內(nèi)阻斷毒素，抑制毒素穿透腸道屏障進(jìn)入血液循環(huán)。諸多可阻斷毒素作用的小分子抑制劑被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，按其阻斷位點(diǎn)不同目前可分為以下幾種類別。

1. 阻斷毒素與宿主細(xì)胞結(jié)合：默克公司研發(fā)了用于中和TcdA和TcdB的特異性人源單克隆抗體Actoxumab(ACT)和Bezlotoxumab(BEZ)。臨床試驗(yàn)[31]中單獨(dú)使用ACT的治療組在中期分析后因有效性和安全性原因停止試驗(yàn)；單獨(dú)使用BEZ組的感染復(fù)發(fā)率為16.5%，顯著低于安慰劑組(26.6%)。目前默克公司已提交BEZ的上市申請(qǐng)。使用單克隆抗體被動(dòng)免疫可最大程度避免患者在急性感染后復(fù)發(fā)，對(duì)有復(fù)發(fā)感染高風(fēng)險(xiǎn)的患者具有良好的成本效益[32]。然而對(duì)于高危人群是否需早期預(yù)防性使用毒素中和抗體尚存爭(zhēng)議。Yuan等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，CSPG4以及由CSPG4蛋白N端640個(gè)氨基酸組成的多肽具有TcdB細(xì)胞受體的功能，抑制CSPG4功能或其表達(dá)可顯著降低TcdB毒性，此為阻斷毒素與宿主細(xì)胞結(jié)合提供了新途徑。

2. 抑制核內(nèi)體酸化：核內(nèi)體酸化可誘發(fā)毒素蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致毒素釋放入胞。Slater等[33]對(duì)作用于宿主細(xì)胞的可抑制核內(nèi)體酸化的化合物進(jìn)行研究，結(jié)果顯示刀豆素A對(duì)細(xì)胞免受TcdB毒性作用的保護(hù)率為100%、川楝素為30%、腐敗菌素B為26%～50%。Tam等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，抗瘧藥米帕林可通過抑制核內(nèi)體酸化，從而有效抑制TcdB誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。上述研究進(jìn)一步證實(shí)了抑制核內(nèi)體酸化的小分子化合物的潛在治療價(jià)值。

3. 抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性：毒素蛋白中具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的GTD片段可破壞細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)于毒素發(fā)揮毒性作用不可或缺。Tam等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，天然黃酮類化合物根皮素可非競(jìng)爭(zhēng)性直接抑制毒素GTD的活性，且呈劑量依賴性。

4. 抑制毒素自催化過程：毒素蛋白通過自催化分解過程釋放具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的GTD片段，阻斷該過程可阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Bender等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，低分子量化合物依布硒可抑制TcdB對(duì)細(xì)胞的致死作用。依布硒含有活性硒基團(tuán)，可共價(jià)結(jié)合半胱氨酸殘基阻斷毒素的自催化過程。

五、總結(jié)與展望

盡管近年來對(duì)C.difficile毒素的研究越來越關(guān)注其基因調(diào)控機(jī)制，然而基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)過程尤為復(fù)雜，難以對(duì)其定性和定量分析。近來研究[35]發(fā)現(xiàn)糞腸球菌的堿性磷酸酶基因phoZ可作為報(bào)告基因定性或定量分析C.difficile的基因轉(zhuǎn)錄，這將為進(jìn)一步研究基因操縱和分子分析提供高效便捷的方法。研究[36]發(fā)現(xiàn)C.difficile的毒素基因表達(dá)亦受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，通過破壞該系統(tǒng)可切斷細(xì)菌間轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，從而削弱菌體產(chǎn)毒的能力，這為研究非抗菌藥物治療C.difficile感染提供了新思路。此外，研發(fā)針對(duì)毒素的抗C.difficile感染疫苗具有潛在可能性，抗C.difficile疫苗為預(yù)防該菌感染提供了一種有效且相對(duì)價(jià)廉的方法。然而，接種疫苗或單克隆抗體治療均不能清除C.difficile在腸道的定植，因而隔離傳染源仍是防控C.difficile感染的最主要措施。

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(2016-03-22收稿；2016-09-28修回)

Regulatory Mechanism ofClostridiumdifficileToxin-associated Pathogenic Gene and Anti-toxin Treatment

LINQianyun,FEIJiaxi,CHENYe.

DepartmentofGastroenterology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofGastroenterology,Guangzhou(510515)

CHEN Ye, Email: yechen@smu.edu.cn

Clostridiumdifficile(C.difficile) is a major nosocomial infection pathogen and the principal causative agent of antibiotic-associated diarrhea. The toxigenicC.difficilestrains cause colonic injury and inflammation mainly by secreting enterotoxin A (TcdA) and cytotoxin B (TcdB). The severity ofC.difficileassociated disease (CDAD) is correlated to the toxin level during host infection. However, the toxigenic capacity ofC.difficilevaries widely among strains, which correlates with the gene regulation involved during toxin production. This article reviewed the regulatory mechanism ofC.difficiletoxin-associated pathogenic gene and anti-toxin treatment.

Clostridiumdifficile; Bacterial Toxins; Gene Regulation; Therapy

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.01.011

*本文通信作者，Email: yechen@smu.edu.cn