黃 芳，吳惠勤，朱志鑫，黃曉蘭，羅輝泰，林曉珊，馬立果，鐘巧麗，蔣婭蘭

(中國廣州分析測試中心 廣東省分析測試技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070)

研究報告

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查減肥類中藥及保健品中非法添加30種化學(xué)藥

黃 芳*，吳惠勤，朱志鑫，黃曉蘭，羅輝泰，林曉珊，馬立果，鐘巧麗，蔣婭蘭

(中國廣州分析測試中心 廣東省分析測試技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070)

建立了中藥及保健品中30種減肥類化學(xué)藥的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)快速篩查方法。實驗優(yōu)化了前處理方法、色譜分離條件和質(zhì)譜參數(shù)。樣品采用甲醇超聲萃取，Agilent poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色譜柱分離，流動相為乙腈-水溶液(含10 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸，10%甲醇)，梯度洗脫，流速0.25 mL/min,采用正負離子切換模式的電噴霧質(zhì)譜檢測，多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(MRM)。該方法能同時篩查30種化學(xué)藥，覆蓋面廣，簡便、快速、準(zhǔn)確可靠，已用于減肥類中藥及保健品中非法添加化學(xué)藥的篩查及檢測。

減肥類化學(xué)藥；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；中藥及保健品

隨著社會的發(fā)展，人們物質(zhì)生活越來越豐富，肥胖人群增多，加上人們對審美觀念的變化，使得減肥成為現(xiàn)代社會的熱門話題。面對減肥，多數(shù)人會選擇相對輕松的吃藥方式，認(rèn)為吃藥可以代替減肥運動和飲食控制。由此市場上出現(xiàn)了各式各樣的減肥藥產(chǎn)品，為達到見效快的目的，有些產(chǎn)品打著純中藥制劑的旗號，實際在其中添加了具有減肥或輔助減肥效果的化學(xué)藥，例如有食欲抑制劑西布曲明、瀉藥酚酞、利尿劑噻嗪酮、降糖藥二甲雙胍等，而消費者在不知情的情況下長期服用這些產(chǎn)品，會對身體產(chǎn)生極大傷害。由于在復(fù)雜中草藥體系中添加化學(xué)藥具有隱蔽性且不易檢出的特征，近年來雖然相關(guān)部門加大力度對市場抽檢以及風(fēng)險評估等監(jiān)管活動，但見效不佳，非法添加行為仍屢禁不止[1-2]。

針對減肥類藥物的檢測，我國現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)有藥品補充檢驗標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中規(guī)定了非法添加的3項減肥類化學(xué)藥西布曲明、麻黃堿、芬氟拉明的檢測方法，而實際檢驗發(fā)現(xiàn)，除了含有這3種成分，另有部分產(chǎn)品還含有其它功效類似的降糖藥、利尿藥和降脂藥。因此采用現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)不能達到有效監(jiān)管目的，需要建立品種更多、覆蓋面更廣的多成分同時篩查方法作技術(shù)支撐。近年來減肥藥物的檢測方法有高效液相色譜法[4-5],但此法只能通過保留時間及紫外吸收光譜定性，不能確證化合物的結(jié)構(gòu)信息，需要結(jié)合質(zhì)譜確證才能用于實際工作中；而現(xiàn)有報道最多的是采用靈敏度高、選擇性好的液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[6-8],其中王柯等[8]建立了HPLC-MS/MS測定28種減肥類藥物的分析方法，是所有報道中藥物種類最多的方法。近年來本課題組一直在研究該類物質(zhì)的篩查檢測方法[9]，在篩查品種以及檢測技術(shù)上有了較多的積累，現(xiàn)建立了能同時檢出30種減肥類化學(xué)藥的快速篩查方法。這30種物質(zhì)均是實際檢測工作中被檢測或剖析出來的成分，如西布曲明和酚酞的被檢出頻率最高；氟西汀是從實際樣品中通過剖析鑒定出的成分；氯卡色林是2012年美國新批準(zhǔn)上市的新一代減肥藥[10]，檢測方法尚無文獻報道。本文所建立的方法有以下優(yōu)勢：①能同時篩查30種化學(xué)藥，覆蓋面廣，對有些天然藥物如大黃素、咖啡因、茶堿等因不易判斷是否非法添加而不列入本方法，方法更實用；②氯卡色林和氯貝丁酯為文獻尚未報道的非法添加成分；③采用正、負離子切換模式采集數(shù)據(jù)，提高了氯噻嗪、氫氯噻嗪、噻呋米和氯噻酮的靈敏度，達到同時測定的目的。本方法已經(jīng)應(yīng)用于實際樣品的檢測，為相關(guān)監(jiān)管部門提供了技術(shù)支撐，可為此類非法添加的風(fēng)險評估提供服務(wù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 SL Series RRLC /6410B Triple Quard MS 快速高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀( 美國安捷倫公司);賽多利斯TP-114電子天平(美國Sartorious公司);KQ2200型臺式機械超聲波清洗器(東莞市超聲波設(shè)備有限公司)。甲醇、乙腈(色譜純，德國Merk公司)，乙酸銨(阿拉丁試劑)，實驗用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

30種標(biāo)準(zhǔn)品：二甲雙胍、阿卡波糖、氯噻嗪、苯乙雙胍、氫氯噻嗪、羅格列酮、氯卡色林、氯噻酮、芬氟拉明、吡格列酮、噻呋米、氟西汀、酚酞、去甲基西布曲明(東布曲明)、西布曲明、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、阿托伐他汀、格列齊特、比沙可啶、格列苯脲、格列美脲、格列喹酮、氯貝丁酯、瑞格列奈、洛伐他汀、辛伐他汀、利莫那班、非諾貝特、奧利司他，純度均大于 95.2%,均購自中國食品藥品檢定研究院和德國 Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱各標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，用甲醇(二甲雙胍和阿卡波糖用水)超聲溶解并定容至10 mL，得到500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，臨用時以基質(zhì)提取液將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

片劑去除糖衣部分，磨成細粉，膠囊取內(nèi)容物，準(zhǔn)確稱取0.1 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇8 mL，超聲處理20 min，甲醇定容至刻度，過0.20 μm微孔濾膜，待測。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)，流動相：A為乙腈，B為水溶液(含有10 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸，10%甲醇)，梯度洗脫程序：0～2 min， 100% B；2～3 min，100%～75% B；3～5 min， 75%～20% B；5～8 min， 20%～0% B；8～10 min， 0% B；10～11 min， 0%～100% B；11～14 min， 100% B。流速0.25 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量2 μL。

離子源為電噴霧(ESI)離子源，干燥氣(N2)溫度350 ℃，霧化氣(N2)壓力275.8 kPa，干燥氣(N2)流量10 L/min，電噴霧電壓4 000 V，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，采用正負離子切換方式采集，優(yōu)化后的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 30種減肥化學(xué)藥的質(zhì)譜分析參數(shù)

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

二甲雙胍和阿卡波糖均在水中易溶，在甲醇中溶解，在乙醇中微溶，阿卡波糖在乙腈中不溶，其余各藥物均在甲醇中溶解。為了獲得較好的回收率和除雜效果，實驗對比了純甲醇、80%甲醇、60%甲醇3種提取溶劑的提取效果，結(jié)果表明，純甲醇作提取劑時每個成分能得到理想的回收率，且濾液潔凈，無需進一步凈化，簡化了樣品前處理過程，因此采用甲醇作為提取溶劑。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將30種化學(xué)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀進行參數(shù)優(yōu)化，獲得相應(yīng)的[M+H]+和[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，然后針對母離子作二級子離子全掃描，獲得碎片離子信息，選擇豐度較高的2個碎片離子作特征離子，優(yōu)化碰撞能量使其響應(yīng)最大，最后得到該化合物的2個MRM離子對及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)。

由于不同物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)各異，在電噴霧離子源中的離子化程度不同，優(yōu)化參數(shù)時需采用不同濃度進樣，才能得到理想?yún)?shù)?；衔锫蓉惗□ゲ灰纂x子化，其濃度在10 mg/L以下不能得到分子離子峰，改用較大濃度100 mg/L進樣，才能得到其分子離子峰m/z243+，氯噻嗪、氯噻酮、噻呋米和氫氯噻嗪在理論上采用正、負離子檢測均可，因此實驗分別優(yōu)化得到其正、負離子的MRM參數(shù)。

為得到每種物質(zhì)的理想靈敏度，實驗對比采用正離子(MRM)模式和正、負離子切換采集MRM模式[12]下氯噻嗪、氯噻酮、噻呋米和氫氯噻嗪的檢出限，結(jié)果顯示，正離子模式下氯噻嗪和氯噻酮的檢出限為5 mg/kg，噻呋米和氫氯噻嗪為10 mg/kg，而正負離子切換模式下能得到更低的檢出限，其中氯噻嗪、氫氯噻嗪和噻呋米為0.01 mg/kg；氯噻酮為0.05 mg/kg(見表2 )，比正離子模式低1～2個數(shù)量級，大大增加了此類物質(zhì)的靈敏度。因此，本實驗選用正負離子切換模式的MRM模式采集數(shù)據(jù)。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

各種化學(xué)藥的理化性質(zhì)差別大，在色譜柱上保留特征也不同，為得到理想的色譜峰及合適的分離度，對比選擇了性質(zhì)不同的4種色譜柱，考察其保留特征及分離情況。4種色譜柱分別為A：Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm);B:Agilent Poroshell 120 Phenyl Hexyl(2.1 mm×100 mm，2.7 μm);C：Agilent Poroshell 120 PFP(2.1 mm×100 mm，2.7 μm);D:Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)。研究結(jié)果表明：使用B柱時，阿卡波糖的保留時間短，保留時間為1.61，2.08 min，二甲雙胍出峰時間為1.3 min，幾乎沒有保留而與溶劑同流出；使用C柱時，阿卡波糖的出峰時間為1.5 min幾乎無保留，另有芬氟拉明和氯卡色林的峰形拖尾嚴(yán)重；使用D柱時，阿卡波糖的拖尾嚴(yán)重，各種物質(zhì)相對分離不如A柱理想。由于采用A柱時各色譜峰分離比較理想，峰形對稱，所以選擇A柱作為分離柱。

圖1 30種化學(xué)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of 30 compounds mixed standard solution

流動相對比了甲醇-水和乙腈-水混合溶劑，并分別添加甲酸銨和甲酸考察其對30種化合物的色譜行為和離子化程度。結(jié)果顯示，加入甲酸會提高正離子物質(zhì)的靈敏度，加入甲酸銨可提高負離子物質(zhì)的靈敏度。若只加入甲酸銨，會導(dǎo)致西布曲明的峰嚴(yán)重展寬，幾乎得不到明顯色譜峰，而加入甲酸后峰形明顯改善，檢出限降低2～3個數(shù)量級。雖然加入甲酸后導(dǎo)致阿卡波糖分裂為兩個峰，但兩個峰均峰形尖銳，不影響其檢出限和定量的準(zhǔn)確性；另外在水系中加入10%甲醇，既能改善各物質(zhì)的分離，又能防止流動相產(chǎn)生微生物或沉淀導(dǎo)致柱壓升高。因此流動相體系采用乙腈-甲酸和甲酸銨水溶液，水溶液中含有10%甲醇，梯度洗脫。

綜合以上各因素，得到最佳色譜條件為：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm);流動相：A為乙腈，B為水溶液(含有10 mmol/L甲酸銨、0.1%甲酸、10%甲醇)，此條件下所得各種化合物的總離子流圖和定量特征離子流圖如圖1～2所示。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

本研究通過標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法[14]考察基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)表示為：基質(zhì)效應(yīng)(ME%)=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液所作曲線的斜率/無基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液所作曲線的斜率-1)/100%,基質(zhì)效應(yīng)為負值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，正值表示存在基質(zhì)增強效應(yīng)。絕對值在 0～20%之間,表示存在較弱的基質(zhì)效應(yīng)；絕對值在 20%～50%之間,表示存在中等的基質(zhì)效應(yīng)；絕對值>50%，表示存在較強的基質(zhì)效應(yīng)。實驗分別用空白基質(zhì)作溶劑和甲醇作溶劑配制相同濃度的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，對30種化合物進行基質(zhì)效應(yīng)評價。結(jié)果表明：30種化合物均存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，其絕對值為3%～68%，其中二甲雙胍基質(zhì)抑制68%，比格列酮基質(zhì)抑制65%，格列喹酮基質(zhì)增強54%；格列比嗪基質(zhì)抑制62%；其余藥物的基質(zhì)效應(yīng)均小于25%。綜合考慮，本實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法消除基質(zhì)影響，對于檢出成分采用加標(biāo)法定量，對于添加量大于0.1%的成分需采用液相色譜-紫外檢測器再次測定以得到準(zhǔn)確定量結(jié)果。

2.5 線性范圍與檢出限

采用空白基質(zhì)提取液作溶劑，選用常見的具有減肥通便效果中藥[15]決明子、荷葉、蘆薈、大黃、番瀉葉、澤瀉、首烏和山楂按照等比例混合粉碎，用甲醇稀釋100倍超聲萃取，過濾待用。配制濃度分別為10,5,1.0,0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.001 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度(X,mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計算回歸方程，以信噪比S/N≥3 時的濃度計算檢出限，以3倍檢出限得到定量下限，結(jié)果見表2。每種物質(zhì)在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.99，檢出限為0.003～0.1 mg/kg，能夠滿足檢測要求。

2.6 回收率與精密度

采用經(jīng)測定不含上述減肥藥物的膠囊，添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進行低、中、高3水平的添加回收率實驗，取6次操作的平均值計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。30種減肥化學(xué)成分的回收率為70.1%～114.8%，RSD均小于15%。另取1份0.1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一日內(nèi)不同時間點(共6個時間點，間隔4 h)測定，得到每種物質(zhì)的日內(nèi)精密度均小于6.0%， 表明方法的靈敏度滿足定量分析要求。

表2 30種減肥化學(xué)藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOD、LOQ、回收率及精密度(n=6)

*the numbers denoted were the same as that in Table 1

2.7 實際樣品的測定

近3年來，本實驗室檢測了客戶委托送檢樣品300多個，樣品類型有膠囊、片劑、原料粉等，其中檢出頻率最高的為西布曲明和酚酞，少部分檢出氯卡色林、氟西汀和二甲雙胍成分；另外采用個人購買方式網(wǎng)購了15種不同品牌和來源的樣品，結(jié)果顯示此類非法添加現(xiàn)象仍然存在，部分典型陽性樣品的檢測結(jié)果見表3。

表3 部分陽性樣品的測定結(jié)果

(續(xù)表3)

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)實際檢測工作的需要以及多年的積累，建立了一種快速篩查非法添加減肥類化學(xué)藥的方法，涉及化學(xué)藥多達30種且具有典型的代表性。該方法覆蓋面廣、靈敏度高，適用于保健品及中成藥非法添加檢測，已用于日常檢測工作中，為監(jiān)管相關(guān)非法添加提供了有力的技術(shù)支持。

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Simultaneous Determination of Thirty Chemical Drugs Illegally Added in Anti-obesity Traditional Chinese Medicine and Health Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUANG Fang*,WU Hui-qin,ZHU Zhi-xin,HUANG Xiao-lan, LUO Hui-tai,LIN Xiao-shan,MA Li-guo,ZHONG Qiao-li,JIANG Ya-lan

(Guangdong Provincial Public Laboratory of Analysis and Testing Technology,China National Analytical Center (Guangzhou),Guangzhou 510070，China )

A high-performance liquid chromatograph-mass spectrometric(LC-MS/MS) method was proposed for the determination of thirty chemical compositions,which were illegally mixed into the antiobesity traditional Chinese medicine and health products.The conditions of extraction and mass parameters were optimized.The drugs were extracted with methonal in ultrasonic condition,separated on a C18chromatographic column using a mixture of acetonitrile and water(containing 10 mmol/L ammonium formate,0.1% formic acid，10%methanol) as mobile phase.The detection of analytes was performed by positive-ion and negative-ion electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS) under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The method was proved to be able of covering large area,simple,rapid,accurate and reliable.It was used in screening and examination of illegally added chemicals in Chinese traditional medicine and health food.

antiobesity chemical drugs;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);Chinese traditional medicine and health food

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.001

2016-08-21；

2016-09-20

廣東省科技計劃項目(2012B040302007)

*通訊作者：黃 芳，碩士，高級工程師，研究方向：分析化學(xué)，Tel：020-37656312， E-mail：thymol206@126.com

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)01-0002-07