林江麗，王金霞，張雪霞，王吉德

(新疆大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

RP-HPLC法測定SO2處理前后新疆無核葡萄干中的B族維生素

林江麗，王金霞，張雪霞，王吉德*

(新疆大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

建立了高效液相色譜同時(shí)測定SO2處理前后無核葡萄干中4種B族維生素(VB1,VB2,VB3和VB6)的分析方法?？疾炝肆鲃?dòng)相組成、pH值及梯度洗脫程序?qū)Ψ蛛x效果的影響。最終采用pH 4.4緩沖溶液和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，4種B族水溶性維生素的線性范圍為0.1～20 mg/L，r2>0.999，檢出限為0.013～0.064 mg/L，方法的平均回收率為83.0%～101.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～4.8%。同時(shí)利用該法對SO2處理前后無核葡萄干中4種維生素含量的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，空白無核葡萄干中VB6的含量最大，VB1含量較低；但SO2處理對葡萄干中VB1的含量影響最大，其它3種B族維生素的含量變化不大。該方法簡便，快速，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性均較好，可用于葡萄干中B族維生素的測定。

高效液相色譜；SO2處理；B族維生素；葡萄干

新疆無核白葡萄是最重要的制干品種[1]，其品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)豐富，具有補(bǔ)血?dú)?、抗衰老、抗氧化和消炎等功效[2-5]，應(yīng)用開發(fā)前景廣闊。葡萄干除了富含人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、葡萄糖等物質(zhì)外，還含有豐富的水溶性維生素[6-9]，其中維生素的含量對葡萄干的品種有重要影響。B族水溶性維生素是人體正常生理活動(dòng)必不可少的物質(zhì)，其攝取量缺乏會(huì)引起嚴(yán)重的疾病，人體嚴(yán)重缺乏VB2和VB3時(shí)，常表現(xiàn)為口角炎、皮炎、腹瀉和癡呆等癥狀，缺乏VB1會(huì)導(dǎo)致腳氣病[10]。新疆無核葡萄在干制過程中常添加一定量的SO2及其鹽類來抑制果粒褐變并延長其貨架期，但添加的SO2及其鹽類易與維生素等物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[11]，這不僅增加了SO2的殘留量，而且直接影響葡萄干的品質(zhì)。

目前對于水溶性維生素分析檢測的方法有分子熒光法[12-13]、微生物法(MBA)[14-15]、毛細(xì)管電泳(CE)[16-17]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[18-20]和高效液相色譜法(HPLC)[21-24]等。高效液相色譜法因其分離速度快，樣品前處理簡單，樣品用量少而廣泛應(yīng)用于水溶性維生素的分離分析，其分析研究對象多為樣品基質(zhì)相對簡單的維生素片和液態(tài)樣品(如蜂蜜、飲料)中維生素的測定。但目前，國內(nèi)外采用HPLC法對經(jīng)SO2處理的無核葡萄干中B族維生素的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本文采用RP-HPLC法對新疆無核葡萄干中的4種B族水溶性維生素(VB1，VB2，VB3和VB6)進(jìn)行分析，同時(shí)考察了SO2處理對無核葡萄干中4種B族水溶性維生素的影響，并對樣品前處理和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。旨在對無核葡萄干的品質(zhì)評價(jià)提供理論參考，同時(shí)也對SO2處理的食品中B族維生素的質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

空白葡萄干為采摘后的無核葡萄在無任何添加的情況下避光自然陰干；商品葡萄干為市售。

SO2處理葡萄干：100 g空白葡萄干置于干燥器中，稱取5.0 g偏重亞硫酸鈉于50 mL燒杯中，加入50%硫酸20 mL，產(chǎn)生的SO2氣體對空白葡萄干樣品進(jìn)行熏蒸處理7 d后，取出葡萄干樣品密封置于-80 ℃保存待測。

乙腈(色譜純，Dikma公司)，VB1,VB2,VB3,VB6對照品(純度≥99%,阿拉丁試劑有限公司)；磷酸二氫鉀為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為電阻率18.2 MΩ·cm的高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SPD-20A型高效液相色譜儀(島津公司)；PHB-8型筆式pH計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；Coulter Avanti J-25型高速離心機(jī)(美國Beckman公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Classic UF型純水儀(韓國Classic UF公司)；FW-80型高速粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；微孔濾膜0.22 μm(上海興亞凈化材料廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取VB1，VB2，VB3和VB6標(biāo)準(zhǔn)品各0.002 5 g，用pH 2.5的HCl溶液分別定容于25.00 mL容量瓶中，分別配成各維生素質(zhì)量濃度為100.0 mg/L的儲(chǔ)備液，用錫箔紙作避光保存，放置4 ℃冰箱中。檢測前根據(jù)需要配成不同質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液。

1.3.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化向低溫保存的葡萄干樣品中加入液氮使樣品低溫均質(zhì)化。稱取均質(zhì)化的葡萄干樣品6.00 g置于50 mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入25.00 mL pH 2.5的HCl溶液密封。調(diào)節(jié)浸提液pH值范圍為1.0～4.0，浸提溫度為10～50 ℃，超聲時(shí)間為10～40 min。浸提液高速離心10 min(10 000 r/min)，上清液定容至25.00 mL容量瓶中。

取1.00 mL樣液，加入0.1 g聚酰胺吸附劑，高速離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP 柱(250 mm × 4.6 mm,5.0 μm)，流動(dòng)相：A為乙腈，B為一定pH值的緩沖溶液；流速:0.6 mL/min，柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 浸提液pH值對B族維生素提取量的影響考察了浸提液pH值(1.0，2.0，2.5，3.0，4.0)對樣品中4種B族水溶性維生素提取量的影響。結(jié)果表明，隨著浸提液pH值的增大，VB1提取量逐漸減小，當(dāng)pH 1.0時(shí)其提取量最大；VB2和VB6提取量逐漸增大，當(dāng)pH 3.0時(shí)兩種維生素的提取量均達(dá)到最大值；VB3的提取量先增大后減小，當(dāng)pH 2.0時(shí)其提取量最大。綜合上述因素，pH 3.0為VB2和VB6的最佳提取pH值，但該條件下不利于VB1的提取，pH 2.0為VB3的最佳提取條件，且VB1，VB2和VB6的提取量均較大。為了最終確定浸提液的pH值，考察了pH 2.0和3.0兩種不同浸提液中4種B族水溶性維生素的提取量、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。從表1可看出，pH 2.0和3.0時(shí)，4種維生素的測定結(jié)果比較接近，平均回收率為89.2%～103.7%，RSD不大于4.6%，該結(jié)果說明pH 2.0和3.0時(shí)4種維生素均能被充分提取。為了保證樣品中VB1的充分提取且不影響其它維生素的提取量，確定采用pH 2.0的浸提液對樣品中的4種維生素進(jìn)行浸提。

表1 pH 2.0和pH 3.0時(shí)葡萄干中4種B族維生素的提取量、平均回收率和RSDs(n≥3)

2.1.2 浸提溫度對B族維生素提取量的影響考察了浸提溫度(10，20，30，40 ℃)對樣品中4種B族維生素提取量的影響。圖1結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，VB1的提取量逐漸降低；VB2的提取量逐漸增大，VB3的提取量先增加后減小，30 ℃時(shí)其提取量達(dá)到最大值；VB6的提取量逐漸增加，30 ℃后其提取量幾乎不變。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇20 ℃對樣品各維生素進(jìn)行提取。

2.1.3 超聲時(shí)間對B族維生素提取量的影響考察了超聲時(shí)間(10，20，30，40 min)對樣品中4種維生素提取量的影響。結(jié)果顯示，隨著超聲時(shí)間的增加，VB1和VB6的提取量逐漸增大，而VB2和VB3的提取量先增大后減小，當(dāng)超聲時(shí)間分別為20 min和30 min時(shí)，VB2和VB3的提取量達(dá)到最大值。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)最終選擇30 min對樣品各維生素進(jìn)行提取。

圖2 pH 4.4時(shí)4種B族維生素的色譜圖Fig.2 Chromatogram of of four B-vitamins at pH 4.4

2.2 色譜條件的優(yōu)化

調(diào)節(jié)和控制流動(dòng)相pH值是優(yōu)化分離條件的重要因素。調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值(4.0～5.6)，對4種維生素混標(biāo)溶液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，流動(dòng)相pH 4.4時(shí)，4種B族水溶性維生素的分離效果最好(見圖2)，因此確定流動(dòng)相最佳pH值為4.4。

流動(dòng)相的組成是優(yōu)化分離條件的另一重要因素。等度洗脫對于基質(zhì)較為復(fù)雜的葡萄干樣品中的4種B族水溶性維生素不能實(shí)現(xiàn)較好的分離分析。因此須采用梯度洗脫來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，以改善樣品中待分析組分的分離效果。通過對樣品中干擾物與目標(biāo)物，以及4種目標(biāo)物之間的相互分離的結(jié)果進(jìn)行分析，最終確定的梯度洗脫程序?yàn)椋?～2.0 min，98%B，2.0～20.00 min，80%B，20.00～30.00 min，98%B。

2.3 方法學(xué)及性能評價(jià)

2.3.1 線性范圍與檢出限配制一系列不同濃度的4種維生素混標(biāo)溶液，進(jìn)行液相色譜分析。以峰面積(Y)對維生素的質(zhì)量濃度(X，mg/L)作圖，得到關(guān)系曲線。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限，其線性關(guān)系與檢出限結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4種B族水溶性維生素在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 2，檢出限均不大于0.064 mg/L，說明此方法可應(yīng)用于樣品中維生素的定量分析。

表2 4種B族維生素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(n≥3)

2.3.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差取6.0 g商品葡萄干樣品，按照“1.3.2”方法進(jìn)行樣品前處理，分別添加維生素VB1，VB2，VB3和VB6標(biāo)準(zhǔn)品適量，每個(gè)添加水平測定3次，進(jìn)行回收率與精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。4種維生素的平均回收率為83.0 %～101.4 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.6 %～4.8 %，方法的準(zhǔn)確度與精密度滿足定量分析的要求。

表3 4種B族維生素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n≥3)

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品(A)與樣品(B)的色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standards(A) and real sample(B)

2.4 實(shí)際樣品的測定

依據(jù)優(yōu)化后的色譜條件測定無核葡萄干中4種B族水溶性維生素的含量，樣品色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖3，測定結(jié)果見表4。從表4可以看出，空白葡萄干(無任何添加自然陰干無核葡萄干)和商品葡萄干中均檢出4種B族維生素，其中空白葡萄干中VB6的含量最高，達(dá)到13.96 mg/kg，VB1的含量最低，僅為2.16 mg/kg。

表4 葡萄干中4種B族維生素的含量(n≥3)

2.5 SO2處理對目標(biāo)物的影響

在最佳色譜條件和樣品提取條件下，分別對SO2處理前后的無核葡萄干樣品中的4種B族水溶性維生素進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。由表4可以看出，葡萄干中添加SO2對4種B族水溶性維生素的含量影響程度不同，SO2處理對無核葡萄干中的VB1含量影響最為顯著，而對其它3種B族維生素含量的影響不大?？瞻缀蜕唐窡o核葡萄干中VB1的含量分別為2.16 mg/kg和2.01 mg/kg，而SO2處理后的無核葡萄干樣品中未檢出VB1。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道SO2及其鹽類易與VB1發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的觀點(diǎn)相一致[13]。上述結(jié)果說明，富含VB1的食品中不能采用添加SO2及其鹽類作為抗氧化劑和抑菌劑。

3 結(jié) 論

由于葡萄干中B族維生素的含量直接影響葡萄干的品質(zhì)，對葡萄干中B族水溶性維生素含量的準(zhǔn)確測定對于葡萄干營養(yǎng)價(jià)值的評定具有重要意義。因此建立了高效液相色譜法測定新疆特色干果無核葡萄干中4種B族水溶性維生素含量的分析方法。該方法在一定濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、回收率及RSD均較好。同時(shí)利用該法對SO2處理前后的無核葡萄干中的4種B族水溶性維生素進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SO2處理對無核葡萄干中的VB1含量影響較大。該方法的建立對食品中B族水溶性維生素的分析檢測提供了技術(shù)支持。

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Determination of B-Vitamins in Xinjiang Currants Treated with SO2by RP-HPLC

LIN Jiang-li，WANG Jin-xia,ZHANG Xue-xia,WANG Ji-de*

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

A RP-HPLC method was developed for the determination of four B-vitamins(VB1,VB2,VB3，VB6) in currant after treated with SO2.The effects of mobile phase,pH value and gradient elution procedure on chromatographic separation were studied.The mobile phase was a mixture of pH 4.4 buffer solution and acetonitrile.Under the optimal conditions,the detection limits of four B-vitamins in currants were in the range of 0.013-0.064 mg/L.The linear ranges were between 0.1 mg/L and 20 mg/L with correlation coefficients(r2) larger than 0.999.The average recoveries for the method were in the range of 83.0%-101.4%while RSDs were in the range of 0.6%-4.8%.At the same time,the contents of these vitamins before and after treated with SO2were investigated.The results showed that the content of VB6in currant was the highest and that of VB1was lower.But the change of VB1content in currant treated with SO2was the largest,and the contents of other three species of B-vitamins changed very little.The method showed the advantages of simplicity,rapidness,accuracy and reproducibility,and was suitable for the determination of B-vitamins in currants.

high performance liquid chromatography(HPLC);SO2;B-vitamins；currants

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.021

2016-08-13；

2016-09-20

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2013211A015)

*通訊作者：王吉德，博士，教授，研究方向：應(yīng)用化學(xué)，Tel:0991-8582807,E-mail：xjuwangjd@163.com

O657.72；O629.4

A

1004-4957(2017)01-0122-05