王建榮，劉丹妮，夏雨，楊玲，劉金山，唐業(yè)，陳麗芝，黃佳樂，李陽源

(廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海，519060)

優(yōu)化密碼子及誘導(dǎo)溫度提高雪白根霉脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)

王建榮，劉丹妮，夏雨，楊玲，劉金山，唐業(yè)，陳麗芝，黃佳樂，李陽源*

(廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海，519060)

根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，通過在線軟件對雪白根霉脂肪酶基因(rnl)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的脂肪酶基因(rnl-opt)GC含量由原來的46%提高到49%，堿基A, T, C,G均勻分布，減少了AT和GC富集區(qū)，適應(yīng)指數(shù)由0.82提升到0.85。將rnl-opt連接到表達(dá)載體pPICZαA并轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中。將含有rnl和rnl-opt的重組工程菌在搖瓶和50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。搖瓶培養(yǎng)條件下，含有rnl和rnl-opt重組工程菌的最大酶活分別為458 、956 U/mL。50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下，含有rnl和rnl-opt重組工程菌的最大酶活和總蛋白濃度分別為14 856 、30 500 U/mL和3.61、7.8 g/L。為了進(jìn)一步提高含rnl-opt重組工程菌的表達(dá)酶活，對其在50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為22 ℃時，含rnl-opt重組工程菌的酶活和細(xì)胞濕重均達(dá)到最大值分別為39 520 U/mL和461 g/L。相對于30 ℃，酶活和細(xì)胞濕重分別提高了30%和16%。

密碼子優(yōu)化；誘導(dǎo)溫度優(yōu)化；雪白根霉；脂肪酶

脂肪酶在油水界面上可催化天然底物油脂水解,在非水相體系中又可催化轉(zhuǎn)酯和酯合成等多種反應(yīng)，由于其特殊的酶學(xué)性質(zhì)使其在不同的工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力[1]。根霉屬脂肪酶作為微生物脂肪酶主要來源之一，因其具有高度的1,3位置專一性，使其在油脂改性、生物柴油、食品加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力[2-3]。研究表明，來源于米根霉的脂肪酶，能水解甘油三酯生成甘油二酯，可應(yīng)用于油脂改性領(lǐng)域；同時米根霉脂肪酶還具有良好的酯化能力，廣泛應(yīng)用于生物柴油的研究[4-5]。華根霉脂肪酶能夠增加面包的比容和彈性,降低面包的硬度使其適用于烘焙行業(yè)[6]。來源于雪白根霉的脂肪酶主要應(yīng)用于油脂改性、加工等領(lǐng)域[7]。

畢赤酵母作為一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有許多優(yōu)點：如遺傳操作簡單；具有完整的蛋白加工系統(tǒng)并且很少分泌自身內(nèi)源蛋白；培養(yǎng)簡單，易于進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)等[8]。為了進(jìn)一步提高異源蛋白在畢赤酵母的表達(dá)量，科研工作者發(fā)明了許多方法如：提高基因在重組酵母的拷貝數(shù)，改變表達(dá)載體的啟動子及信號肽，密碼子優(yōu)化，優(yōu)化發(fā)酵條件等[9-11]。密碼子和溫度優(yōu)化能有效的提高異源蛋白在畢赤酵母的表達(dá)量：編碼異源蛋白的基因中存在許多低頻密碼子，這些低頻密碼子大大降低了異源蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，通過優(yōu)化編碼異源蛋白基因的密碼子可提高其在畢赤酵母的表達(dá)水平[12-13]；降低誘導(dǎo)溫度可以提高重組工程菌的細(xì)胞活性以及重組蛋白的穩(wěn)定性，從而提高異源蛋白的表達(dá)量[14]。

本課題組在之前的研究中，從雪白根霉中克隆得到一條脂肪酶基因，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性分析，發(fā)現(xiàn)其存在許多低頻密碼子[15]。為了提高雪白根霉脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)，在本研究中首次結(jié)合了密碼子和誘導(dǎo)溫度優(yōu)化2種方法，為雪白根霉脂肪酶在畢赤酵母的高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及培養(yǎng)基

Zeocin購自美國Invitrogen公司。高保真Q5酶、T4DNA連接酶購自北京NEB公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI和Not I購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒均購自天根生化有限公司。橄欖油購自益海嘉里投資有限公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。引物由蘇州金維智公司合成。

大腸桿菌用LB液體及LBZ固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。畢赤酵母轉(zhuǎn)化子用固體YPDZ培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化子篩選以及搖瓶培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基分別為BMGY 和BMMY。酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)為BSM培養(yǎng)基。LB、LBZ、YPDZ、BMMY、BMGY和BSM培養(yǎng)基分別參照Invitrogen 公司的酵母指導(dǎo)手冊進(jìn)行配制。

1.1.2 載體和菌種

表達(dá)載體pPICZαA-rnl由本實驗室在之前的實驗中構(gòu)建得到。畢赤酵母X33以及表達(dá)載體pPICZαA購自美國Invitrogen公司。克隆載體T-Vector pMD20購自寶生物工程(大連)有限公司。大腸桿菌top10為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 雪白根霉脂肪酶基因密碼子分析及優(yōu)化

通過在線軟件SignalP 4.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ SignalP/)對雪白根霉脂肪酶進(jìn)行信號肽預(yù)測。針對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過在線軟件Graphical Codon Usage Analyser (http://gcua.schoedl.de/)對不含信號肽的雪白根霉脂肪酶基因(GeneBank 登陸號為：AB013496)的密碼子進(jìn)行分析，找出低頻密碼子。根據(jù)找出的低頻密碼子通過軟件DNA2.0 software(http://www.dna20.com)對rnl進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的雪白根霉脂肪酶基因(rnl-opt) 由蘇州金維智公司進(jìn)行合成。

1.2.2 重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及高酶活轉(zhuǎn)化子的篩選

將合成的雪白根霉脂肪酶基因(rnl-opt)用EcoRI和Not I進(jìn)行酶切并和 pPICZαA進(jìn)行連接，得到表達(dá)載體pPICZαA-rnl-opt。分別將表達(dá)載體pPICZαA-rnl-opt和pPICZαA-rnl線性化，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于YPDZ平板上。將轉(zhuǎn)化子分別接入含有1.4 mL BMGY的24孔板中，30 ℃培養(yǎng)36 h后，按體積分?jǐn)?shù)1%的比例加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h取樣進(jìn)行測定。脂肪酶活性測定以p-Nitrophenyl caprylate(C8)為底物，先加入100 μL pH 7.5的磷酸緩沖液，然后分別加入10 μL底物和10 μL 稀釋好的酶液，反應(yīng)5 min后加入100 μL 0.2 g/L的SDS溶液終止反應(yīng)，最后在405 nm條件下測定OD值，根據(jù)OD值計算酶活?？瞻讓φ障燃?.2 g/L的SDS溶液，其他反應(yīng)步驟相同。

1.2.3 重組酵母菌搖瓶培養(yǎng)

為了進(jìn)一步比較方法1.2.2篩選出來的高酶活轉(zhuǎn)化子，將培養(yǎng)條件擴(kuò)大到搖瓶培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)參照之前報道的方法進(jìn)行[16]。分別將高酶活菌株接入BMGY培養(yǎng)基30 ℃，250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)至OD600達(dá)到2～6。離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基將菌體重懸稀釋至OD600為1.0，每過24 h按體積分?jǐn)?shù)1%的比例向BMMY培養(yǎng)基中補加甲醇。同時對菌體濃度和脂肪酶酶活進(jìn)行測定。脂肪酶活性測定參照國標(biāo)GBT/23535—2009報道的方法進(jìn)行。

1.2.4 重組酵母工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)

為了進(jìn)一步比較優(yōu)化后的rnl-opt和原始rnl在畢赤酵母的表達(dá)酶活，將搖瓶培養(yǎng)篩選出來的高酶活轉(zhuǎn)化子在50 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。將單菌落的重組酵母工程菌接入含有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30 ℃，250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。再將過夜培養(yǎng)的重組酵母工程菌按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入含有100 mL YPD培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，30 ℃，250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，至OD600大于10。將二次過夜培養(yǎng)的重組酵母工程菌按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入含有20 L BSM培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐。重組酵母工程菌在50 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件為：溫度為30 ℃、ph值5.0、攪拌速度為500 r/min、空氣流量為40 L/min。培養(yǎng)初期，以甘油作為碳源供菌體生長。當(dāng)菌體濕重達(dá)到一定的量，停止流加甘油，待甘油被菌體吸收完后(溶氧迅速上升)開始用甲醇誘導(dǎo)。甲醇的添加量根據(jù)溶氧進(jìn)行調(diào)整，整個發(fā)酵過程使溶氧大于20%。培養(yǎng)過程中，每24 h取樣測定菌體濕重、酶活、總蛋白濃度以及SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

為了研究誘導(dǎo)溫度對重組工程菌X33/rnl-opt分泌RNL的影響，將重組工程菌X33/rnl-opt在50 L發(fā)酵罐不同的誘導(dǎo)溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。具體步驟如下：甘油流加階段培養(yǎng)溫度為30 ℃，當(dāng)甘油流加完進(jìn)入誘導(dǎo)階段，誘導(dǎo)溫度分別為30 、28 、25、22 ℃。培養(yǎng)過程中，每24 h取樣測定菌體濕重、酶活以及總蛋白濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1rnl密碼子分析及優(yōu)化

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，通過在線軟件對rnl基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在原始rnl基因當(dāng)中存在多個低頻密碼子如編碼Gly的GGC、編碼Arg的CGA和CGT、編碼Ser的AGT、編碼Leu的CTC以及編碼Pro的CCC(表1)。這些低頻密碼子影響rnl在畢赤酵母的表達(dá)。根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，通過密碼子優(yōu)化，我們用高頻密碼子替換了這些低頻密碼子，如將編碼Gly的GGC替換為GGT、編碼Arg的CGA和CGT替換為AGA等。經(jīng)過優(yōu)化，rnl基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)由0.82提升到0.85，GC含量由原來的46%提高到49%。堿基A, T, C和G均勻分布于優(yōu)化后的rnl基因，減少了AT和GC富集區(qū)，利于rnl基因在畢赤酵母的表達(dá)。通過對優(yōu)化后的rnl-opt基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)總共有232個堿基進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的rnl-opt基因與原始rnl基因的相似性為85%。

表1 rnl原始基因與優(yōu)化后的rnl-opt基因密碼子比較

2.2 重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及高酶活轉(zhuǎn)化子的篩選

分別將表達(dá)載體pPICZαA-rnl-opt和pPICZαA-rnl線性化，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33得到含有rnl-opt基因和rnl基因的重組轉(zhuǎn)化子。通過分析測定，篩選到4個高酶活轉(zhuǎn)化子，2個含有rnl-opt基因(命名為X33/rnl-opt-1和X33/rnl-opt-2)，另外2個含有rnl基因(命名為X33/rnl-1和X33/rnl-2)。為了進(jìn)一步比較這4個轉(zhuǎn)化子的酶活，分別在搖瓶培養(yǎng)條件下測定這4個轉(zhuǎn)化子的酶活及總蛋白濃度。如圖1所示，搖瓶培養(yǎng)120 h后，X33/rnl-1、X33/rnl-2、X33/rnl-opt-1和X33/rnl-opt-2的酶活分別為458、436、925 、956 U/mL?？偟鞍诐舛确謩e為0.11、0.1、0.19 、0.21 g/L(圖1)。通過分析比較，選擇重組菌株X33/rnl-1和X33/rnl-opt-2做下一步實驗的出發(fā)菌株。

圖1 重組工程菌搖瓶培養(yǎng)Fig.1 Lipase production and total protein concentration of recombinant strain in shake-flask level

2.3 重組酵母工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)

重組工程菌株X33/rnl-1和X33/rnl-opt-2在50 L發(fā)酵罐的生長及產(chǎn)酶曲線如圖2所示。由圖2可知：當(dāng)誘導(dǎo)時間為168 h，重組工程菌X33/rnl-opt-2和X33/rnl-1的發(fā)酵酶活均達(dá)到最大分別為30 500 、 14 856 U/mL. 相對于原始基因，密碼子優(yōu)化后的rnl-opt基因的表達(dá)酶活提高了1.05倍。當(dāng)誘導(dǎo)時間為192 h，重組工程菌X33/rnl-opt-2總蛋白濃度達(dá)到最大值為7.8 g/L，是重組工程菌X33/rnl總蛋白濃度的 2.16倍。當(dāng)誘導(dǎo)時間為192 h重組工程菌X33/rnl-opt-2和X33/rnl-1的細(xì)胞濕重均達(dá)到最大值分別為405 、402 g/L。SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，重組RNL的分子量約為37 kDa，與預(yù)測的大小相近。SDS-PAGE蛋白膠表明重組工程菌X33/rnl-opt-2分泌重組RNL的量明顯高于重組工程菌X33/rnl-1。用Quantity One 軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)上清液中重組RNL蛋白約占總蛋白含量的86%。

圖2 重組工程菌X33/rnl-opt-2 和X33/rnl-1 50 L發(fā)酵培養(yǎng)Fig.2 Lipase activity and total protein content of X33/rnl-opt-2 and X33/rnl-1 during fed batch fementation in 50 L bioreactor

M-蛋白Marker；1-X33/rnl-1培養(yǎng)168 h上清蛋白;2-X33/rnl-opt-2培養(yǎng)168 h上清蛋白圖3 SDS-PAGE分析重組蛋白Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the recombinant lipase

2.4 優(yōu)化誘導(dǎo)溫度

重組工程菌X33/rnl-opt-2在不同誘導(dǎo)溫度下的產(chǎn)酶和細(xì)胞濕重如圖4所示。

圖4 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化Fig.4 Lipase activity and DCW of X33/rnl-opt during fed batch fementation in 50 L bioreactor under different induction temperature

由圖4可知,誘導(dǎo)溫度與重組工程菌X33/rnl-opt-2的產(chǎn)酶及生長有著密切的關(guān)系。隨著誘導(dǎo)溫度下降，重組工程菌X33/rnl-opt-2的產(chǎn)酶能力以及細(xì)胞濕重逐漸上升。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為22 ℃時，重組工程菌X33/rnl-opt-2在50 L發(fā)酵罐誘導(dǎo)168 h后，酶活和細(xì)胞濕重均達(dá)到最大值分別為39 520 U/mL和461 g/L。相對于30 ℃，誘導(dǎo)溫度為22 ℃時，酶活和細(xì)胞濕重分別提高了30%和16%。由圖5可知降低誘導(dǎo)溫度，可以提高工程菌X33/rnl-opt-2表達(dá)重組RNL的水平，隨著誘導(dǎo)溫度的降低，上清酶液中重組RNL的濃度越來越高。

M-蛋白Marker；1～4-分別是誘導(dǎo)溫度為30,28,25和22 ℃圖5 SDS-PAGE分析X33/rnl-opt-2在不同誘導(dǎo)溫度下培養(yǎng)168 h后的重組蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of the recombinant lipase under different induction temperature

3 討論

畢赤酵母作為一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)表達(dá)方面有著許多優(yōu)點：如培養(yǎng)條件簡單、易于操作、便于工業(yè)化生產(chǎn)、可高效表達(dá)外源蛋白等。密碼子優(yōu)化可以有效地提高異源基因在畢赤酵母的表達(dá)水平。研究表明，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對米根霉脂肪酶基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化使其表達(dá)酶活從28.7 U/mL提高到132.7 U/mL[17]。通過優(yōu)化黑曲霉脂肪酶2的密碼子，使其在畢赤酵母的表達(dá)酶活提高了11.6倍[18]。本文通過優(yōu)化rnl的密碼子，提高了其在畢赤酵母X33的表達(dá)量。在搖瓶培養(yǎng)條件下，優(yōu)化后的rnl-opt最高表達(dá)酶活為956 U/mL，是原始基因表達(dá)酶活的2.08倍。在50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下，優(yōu)化后的rnl-opt最大酶活為30 500 U/mL，是原始基因表達(dá)酶活的2.05倍。誘導(dǎo)溫度也是影響異源蛋白在畢赤酵母表達(dá)水平的重要因素。研究表明降低誘導(dǎo)溫度可以降低細(xì)胞的死亡率，提高細(xì)胞活性，有利于重組蛋白的表達(dá)[14]。在本研究中，我們優(yōu)化了重組工程菌X33/rnl-opt-2在50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)溫度，結(jié)果表明：降低誘導(dǎo)溫度可以提高工程菌X33/rnl-opt-2的產(chǎn)酶水平以及細(xì)胞濕重；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為22 ℃時，重組工程菌X33/rnl-opt-2的表達(dá)酶活和細(xì)胞濕重均達(dá)到最大值分別為39 520 U/mL和461 g/L。本研究中rnl-opt在畢赤酵母的最大表達(dá)酶活為39 520 U/mL，是迄今根霉來源脂肪酶在畢赤酵母表達(dá)酶活最高的，如來源于米根霉的脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)酶活為21 000 U/mL，來源于華根霉的脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)酶活587 U/mL[19-20]。但由于測定條件，培養(yǎng)條件、底物特異性等條件的不同，脂肪酶酶活呈現(xiàn)很大的差異性，因此脂肪酶酶活的比較必須在相同的條件下進(jìn)行，才具有可比性。本研究結(jié)合了密碼子優(yōu)化和誘導(dǎo)溫度優(yōu)化2種方法將rnl-opt在畢赤酵母的最大表達(dá)酶活從14 856 U/mL 提高到39 520 U/mL。本研究結(jié)果表明，將密碼子優(yōu)化和誘導(dǎo)溫度優(yōu)化2種方法進(jìn)行結(jié)合能有效提高異源蛋白在畢赤酵母的表達(dá)水平。

[1] SINGH A K, MUKHOPADHYAY M. Overview of fungal lipase: a review[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 166(2): 486-520.

[2] 顏興和，王棟，徐巖. 根霉脂肪酶的研究進(jìn)展[J].工業(yè)微生物，2005, 35 (3): 45-49.

[3] ADAK S, DATTA S, BHATTACHARYA S. Role of spacer length in interaction between novel gemini imidazolium surfactants andRhizopusoryzaelipase[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 81:560-567.

[4] ZHOU Gui-xiong , CHEN Guan-yi , YAN Bei-bei . Two-step biocatalytic process using lipase and whole cell catalysts for biodiesel production from unrefined jatropha oil[J]. Biotechnology Letters, 2015, 37(10):1 959-1 963.

[5] LUNA C, VERDUGO C, SANCHO E D, et al. Biocatalytic behaviour of immobilizedRhizopusoryzaelipase in the 1,3-selective ethanolysis of sunflower oil to obtain a biofuel similar to biodiesel[J]. Molecules, 2014, 19(8):11 419-11 439.

[6] 張巒, 黃立群, 喻曉蔚. 重組華根霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)及其對面團(tuán)熱機(jī)械學(xué)和烘焙特性的影響[J].食品科學(xué)，2010, 31 (13): 158-163.

[7] KOHNO M, ENATSU M, TAKEE R, et al. Thermal stability ofRhizopusniveuslipase expressed in a kex2 mutant yeast[J]. Journal of Biotechnology, 2000, 87(3):203-210.

[8] MACAULEY S. FAZENDA M L, MCNEIL B, et al. Heterologous protein production using thePichiapastoris expression system[J]. Yeast, 2005, 22(3):249-270.

[9] TENG Da, FAN Ying, YANG Ya-lin, et al. Codon optimization ofBacilluslicheniformisbeta-1,3-1,4-glucanase gene and its expression inPichiapastoris[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74(5): 1 074-1 083.

[10] WANG Xiao-feng, SHEN Xu-guang, SUN Yong-chuan, et al. Production ofYarrowialipolyticalipase LIP2 inPichiapastorisusing the nitrogen source-regulated FLD1 promoter[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2012, 87(4): 553-558.

[11] JIA Hui-yong, FAN Guang-sen, YAN Qiao-juan, et al. High-level expression of a hyperthermostableThermotogamaritimaxylanase inPichiapastorisby codon optimization[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2012, 78: 72-77.

[12] YANG Jiang-ke, LIU Li-ying. Codon optimization through a two-step gene synthesis leads to a high-level expression ofAspergillusnigerlip2 gene inPichiapastoris[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2010, 63: 164-169.

[13] LI Yi-hang, ZHANG Bo, CHEN Xiang, et al. Improvement ofAspergillussulphureusendo-beta-1,4-xylanase expression inPichiapastorisby codon optimization and analysis of the enzymic characterization[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010, 160(5): 1 321-1 331.

[14] WANG Yun,WANG Zhi-hao, XU Qing-long, et al. Lowering induction temperature for enhanced production of polygalacturonate lyase in recombinantPichiapastoris[J]. Process Biochemistry, 2009, 44: 949-954.

[15] 王建榮，劉丹妮，李鵬. 雪白根霉脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2014, 40(2): 83-88.

[16] 王建榮, 劉丹妮, 李陽源. 克氏擔(dān)孢酵母脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J]. 食品科學(xué), 2015,36 (3):104-108.

[17] 楊江科，嚴(yán)翔翔，黃日波，等. 米根霉脂肪酶基因pro-ROL和m-ROL在畢赤酵母中的密碼子優(yōu)化、表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的比較分析[J]. 生物工程學(xué)報, 2011,27 (12):1 780-1 788.

[18] YANG Jiang-ke, LIU Li-ying. Codon optimization through a two-step gene synthesis leads to a high-level expression ofAspergillusnigerlip2 gene inPichiapastoris[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2010, 63: 164-169.

[19] WANG Jian-rong, LI Yang-yuan, XU Shu-de, et al. High-level expression of pro-form lipase fromRhizopusoryzaeinPichiapastorisand its purification and characterization[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013,15(1): 203-217.

[20] YU Xiao-wei, WANG Le-le, XU Yan.Rhizopuschinensislipase: Gene cloning, expression inPichiapastorisand properties[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 57: 304-311

Enhanced production ofRhizopusniveuslipase inPichiapastorisby codon and fermentation optimization

WANG Jian-rong, LIU Danni, XIA Yu, YANG Ling, LIU Jin-shan, TANG Ye,CHEN Li-zhi, HUANG Jia-le,LI Yang-yuan*

(Guangdong VTR BIO-TECH Co., Ltd., Zhuhai 519060, China)

The codon usage ofRhizopusniveuslipase gene was optimized by online software according to the preferred codon usage forP.pastoris. The G+C content ofrnlwas increased from 46 to 49% and the nucleotides A, T, C and G dispersed evenly in the optimized gene to eliminate AT-or GC-rich motifs. Furthermore, the codon adaptation index was improved from 0.82 to 0.85. Thernlandrnl-optwere inserted into pPICZαA and transformed toP.pastorisX33. The recombinant strains containingrnlandrnl-optwere cultivated in shaking flask and 50 L bioreactor. In shake-flask level, the maximum lipase activity of X33/rnland X33/rnl-optwere 458 U/mL and 956 U/mL, respectively. The maximum lipase activity and total protein concentration produced by X33/rnland X33/rnl-optwere 14 856 U/mL and 30 500 U/mL, 3.61 g/L and 7.8 g/L. The induction temperature for X33/rnl-optwas optimized in 50 L bioreactor. When the induction temperature was 22 ℃, the maximum lipase activity and cell weight of X33/rnl-optreached 39 520 U/mL and 461 g/L, which was increased 60% and 80% compared with 30 ℃.

codon optimization; induction temperature optimization;Rhizopusniveus; lipase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701004

碩士，工程師(李陽源高級工程師為通訊作者，E-mail：liyangyuanvtr@163.com)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863 計劃)(No. 2014AA093514)

2015-11-09，改回日期：2016-01-13