徐璐??+尹海波??+張俠??+曹雪霖??+盧楠楠??+閆麗華??陳世華??郭善利

摘要：以鹽生植物互花米草（Spartina alterniflora）為試驗材料，利用RACE技術克隆到編碼Na+/H+逆向轉運蛋白的[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因的cDNA全長序列。利用生物信息學軟件及網(wǎng)站對獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質序列進行分析，結果發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列長度為2 277 bp，開放閱讀框為1 623 bp，編碼540個氨基酸殘基，且該基因所編碼的蛋白質與植物的Na+/H+逆向轉運蛋白NHX1 同源，所以命名為[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因。同時氨基酸序列比對顯示，其與蘆葦（Phragmites australis NHX，BAD95562.1）、玉米（Zea mays NHX，XP_008653443.1）、水稻（Oryza sativa NHX，BAA83337.1）等的NHX親緣關系相近，同源相似性依次為94%、92%、91%。利用Qiagene Rotor Gene Q熒光實時定量PCR儀對不同時間鹽處理及ABA處理的互花米草材料進行熒光定量PCR檢測。結果發(fā)現(xiàn)，在鹽處理及ABA處理的不同處理時期，該基因的相對表達量都發(fā)生了明顯的變化，這表明該基因受到了鹽脅迫及ABA脅迫的誘導，由此可以看出[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因與植物的耐鹽性有著密切的關系。

關鍵詞：耐鹽性；互花米草；[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因；相對定量表達

中圖分類號： Q785；Q786文獻標志碼：

隨著土壤鹽堿化面積的不斷增加，植物面臨著越來越嚴峻的高鹽挑戰(zhàn)。土壤中高濃度的鹽分會給植物帶來生理干旱、離子毒害等多種危害，嚴重影響到植物的正常生長發(fā)育，從而抑制農(nóng)作物的高產(chǎn)。對于大部分植物來說，高鹽脅迫對植物的危害主要是由高濃度的Na+積累所導致的。雖然不同植物的耐鹽機制存在差異，但是其基本策略都是保持胞內Na+的平衡[1]。其中，植物體內的液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白（vacuolar Na+/H+antiporter）在植物抗鹽堿的過程中起著至關重要的作用，它可以將細胞質中過多的Na）隸屬禾本科米草屬，是典型高度耐鹽的泌鹽鹽生植物。它起源于美洲大西洋沿岸和墨西哥灣，適宜生活于潮間帶，同時具有很好的耐淹、抗風浪能力。它體內也存在著一類Na+/H+逆向轉運蛋白，以此來減輕Na+毒害。因此，互花米草材料對于研究植物耐鹽機制是一個很好的選擇，但是目前我國關于互花米草作為耐鹽基因資源方面的研究并不多見。為了進一步了解互花米草抗鹽性的分子機制，本研究以互花米草為材料，克隆得到了互花米草Na+/H+逆向轉運蛋白基因[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]，利用生物信息學軟件及網(wǎng)站對獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質序列進行分析，利用Qiagene Rotor Gene Q熒光實時定量PCR儀對互花米草在NaCl及ABA不同處理時間條件下表達量的變化情況進行檢測，為的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

互花米草種子來源于山東萊州海濱，放置于4 ℃保存。取出保存的種子播種于耶土 ∶[KG-*3]黑土=1 ∶[KG-*3]1 的培養(yǎng)基質中，于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h的溫室條件下進行培養(yǎng)，2周后選取長勢一致的植株移栽到小方盆中繼續(xù)培養(yǎng)至4～5葉齡。用于基因克隆的取材：用 600 mmol/L NaCL溶液澆灌幼苗 48 h；用于定量表達分析的取材：分別用600 mmol/L NaCl溶液和 100 μmol/L ABA溶液對幼苗進行澆灌和噴灑，處理時間為0（對照）、3、6、12、24、48 h，每個處理重復3次。所有取材均經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存。

大腸桿菌DH5α為實驗室保存；pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、dNTP Mix、DNA限制性內切酶均購自TaKaRa公司；BIOZOL RNA Kit購于BIOFLUX公司；Reverse Transcriptase試劑盒購于Promega公司；Kanamycin Sulfate購于Sigma公司；試驗中所用其他試劑大多為國產(chǎn)分析純，部分試劑是參照文獻[13]自行配制的，所有引物的合成均由北京華大六合基因公司合成。

1.2試驗方法

反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s；40個循環(huán)），并分析試驗結果。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0進行處理，利用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，差異顯著性水平α=0.05。

2結果與分析

2.1互花米草的克隆及序列分析

根據(jù)實驗室互花米草轉錄組測序結果及Blast比對分析設計特異引物，分別進行5′RACE及3′RACE（圖1），根據(jù)測序結果進行比對拼接獲得[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因全長序列信息（圖2）。

基因全長序列為2 277 bp，開放閱讀框（ORF）為1 623 bp，編碼540個氨基酸殘基（圖2）。ExPASy 在線程序預測其編碼的蛋白質分子質量為 59.4 ku，等電點為8.89。經(jīng)TMHMM在線程序分析得SaNHX1蛋白是一個典型的跨膜轉運蛋白，預測其含有11個跨膜結構域（圖3），這一結果與之前的報道[4，14]是一致的。將克隆到的基因序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對，結果發(fā)現(xiàn)，其與蘆葦、玉米、水稻等的Na+/H+逆向轉運蛋白NHX親緣關系相近，相似性依次為94%、92%、91%。取高度相似（相似度>70%）的部分同源序列，使用Clustal X軟件進行同源序列比對，結果發(fā)現(xiàn)NHX1 蛋白序列具有高度保守區(qū)，且在 SaNHX1 蛋白上含有NHX抑制劑氨氯吡嗪脒結合位點 [15]及糖基化位點（圖4）。從構建的NJ系統(tǒng)進化樹（圖5）上可以看到NHX主要分為兩大類，一類是定位于液泡膜上的蛋白，如AtNHX1、AtNHX2等；另一類是定位于質膜上的蛋白，如AtNHX5、AtNHX6，其中SaNHX1蛋白歸屬于液泡膜蛋白。同時定位到液泡膜上的蛋白又分為單子葉與雙子葉兩類，這說明單子葉植物和雙子葉植物的NHX在進化上存在差異[16]，其中SaNHX1蛋白與單子葉植物的NHX蛋白親緣關系較近。[FL）]

3結論與討論

隨著土壤鹽漬化的加重，Na+/H+逆向轉運蛋白對于植物抵抗外界鹽漬環(huán)境具有非常重要的意義。本試驗從鹽生植物互花米草中克隆得到了編碼液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的基因，對其編碼的蛋白質預測結果顯示，SaNHX1具有典型的跨膜結構域，且跨膜區(qū)數(shù)目與之前的報道一致，同時該蛋白上還存在NHX抑制劑氨氯吡嗪脒結合位點及糖基化位點，這些都是NHX的重要特性。系統(tǒng)進化分析表明，SaNHX1屬于液泡膜型NHX，而且與單子葉植物聚為一類，這表明單子葉植物與雙子葉植物NHX在進化上可能存在著一為進一步探討互花米草的耐鹽機制，本研究利用熒光實時定量PCR儀對互花米草在NaCl 及ABA不同脅迫時間條件下，其[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]表達量進行分析。研究結果顯示，無論是在鹽脅迫下，還是在ABA脅迫下，[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的表達量都發(fā)生了定的差異。

[CM（24]很大的變化，這說明在這2種脅迫下

目前，隨著土壤鹽漬化問題地日益加重，依靠分子生物學手段來克隆相關耐鹽基因[17-18]，并將其轉移到非抗鹽的作物中，以培育出耐鹽的轉基因新品種顯得尤為重要，這不僅可以在一定程度上開發(fā)利用鹽堿土地，而且對于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有非常重要的意義。目前關于[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的過量表達試驗正在進行中。

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