黃陸軍，王冉冉，徐凌川

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

HPLC法測(cè)定土圞兒根皮和塊根中的西瑞香素

黃陸軍，王冉冉，徐凌川

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

建立高效液相色譜法測(cè)定土圞兒根皮和塊根中西瑞香素含量的方法。采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇–0.2%磷酸水溶液(56∶44)為流動(dòng)相等度洗脫，流量為1.0 mL／min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。西瑞香素的質(zhì)量濃度在20～100 μg／mL內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，方法精密度(RSD)為1.23%(n=6)。根皮樣品、塊根樣品的加標(biāo)回收率分別為98.8%，98.2%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.30%，2%(n=6)。該方法快速可靠，可用于土圞兒藥材的質(zhì)量控制。

土圞兒；西瑞香素；高效液相色譜法

土圞兒為豆科植物土圞兒的干燥塊根。土圞兒在《本草拾遺》中描述為“蔓如豆，根圓如卵”［1］，符合《中國(guó)植物志》和《山東植物志》記載土圞兒的形態(tài)特征［2］；《救荒本草》記載土圞兒別名為地栗子，屬于浙江省民間用藥［3］；土芋之“味甘”與土圞兒“味甜”表意一致［4–5］?！侗静菔斑z》中記載土芋可“解諸藥毒，生研水服，當(dāng)吐出惡物盡便止”；《貴州藥植調(diào)查》：“治蛇咬傷，并治療癀，去毒”［6］?！度珖?guó)中草藥匯編》［7］記載土圞兒可用于清熱解毒，化痰止咳等功效。土圞兒含有的成分有丙酸、色氨酸、2-吡啶甲酸、scyllo-肌醇［8］等，其它有效成分的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。

山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室從土圞兒中分離得到一種化合物——西瑞香素，經(jīng)文獻(xiàn)查閱沒有土圞兒中西瑞香素檢測(cè)方法的報(bào)道。西瑞香素為香豆素類化合物，近年來對(duì)其藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)西瑞香素具有較強(qiáng)的血漿蛋白結(jié)合率［9］，西瑞香素體外對(duì)人肺腺癌細(xì)胞AGZY–83-a、人喉癌細(xì)胞Hep2和人肝癌細(xì)胞HepG2有明顯抑制作用［10］以及抗炎抑菌作用［11］，還能明顯降低心肌耗氧量［12］以及降低血壓和血脂的作用［13］。為了進(jìn)一步研究該西瑞香素成分及更好地對(duì)土圞兒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，筆者采用高效液相色譜法對(duì)土圞兒根皮及塊根中的西瑞香素進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Prominence LC–20A 型，杭州賽析科技有限公司；

電子天平：FA1004型，上海精科天平廠；

超生液清洗器：KQ–500E型，昆山市超聲儀器有限公司；

高速粉碎機(jī)：FW–100型，北京市永光醫(yī)療儀器廠；

西瑞香素對(duì)照品：上海圻明生物科技有限公司；

磷酸、甲醇：色譜純，格里斯醫(yī)藥化學(xué)分析有限公司；

土圞兒樣品：采自山東省菏澤市單縣，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為豆科植物土圞兒。

1.2 西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱定西瑞香素對(duì)照品5.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成0.5 mg／mL西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，置于冰箱4℃保存，待用。

1.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取土圞兒塊根和根皮粉末20 g，置于圓底燒瓶中，加入95%的乙醇(為8倍藥材的量)加熱回流2次，第1次回流90 min，第2次回流60 min，合并兩次藥液，濾過，減壓濃縮，所得浸膏用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，稀釋至標(biāo)線，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm)；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇–0.2%磷酸水溶液(體積比56∶44)，流量為1.0 mL／min；等度洗脫；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm。

1.5 色譜圖

在1.4色譜條件下，西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)品與土圞兒供試品的保留時(shí)間分別為9.203，9.194 min，且土圞兒樣品色譜圖附近無其它雜質(zhì)峰干擾，可以斷定土圞兒中含有西瑞香素化學(xué)成分。西瑞香素對(duì)照品與土圞兒樣品的色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 西瑞香素對(duì)照品色譜圖

圖2 土圞兒樣品色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件

以西瑞香素為含量指標(biāo)，進(jìn)行土圞兒提取條件的考察，加熱回流兩次，結(jié)果顯示，第1次回流90 min，第2次回流60 min時(shí)提取效率最好，因此選擇用95%乙醇回流提取兩次。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

采用SPD檢測(cè)器在210～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，采集光譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在345 nm時(shí)西瑞香素的色譜峰面積相對(duì)較高，峰形和分離度良好，基線平穩(wěn)，因此實(shí)驗(yàn)選擇345 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 流動(dòng)相

為實(shí)現(xiàn)西瑞香素的良好分離，實(shí)驗(yàn)考察了等度洗脫，比較了甲醇–0.2%磷酸水溶液、乙腈–0.2%磷酸水溶液、乙腈–0.2%乙酸水溶液3種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，以甲醇–0.2%磷酸水溶液(體積比為56∶44）［14］為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫時(shí)樣品的分離度高、基線平穩(wěn)，各指標(biāo)峰峰形良好，重復(fù)性良好。

2.4 色譜柱的選擇

西瑞香素為香豆素類化合物，極性較大，因此對(duì)比了ZORBAX SB C18和Kromasil C18。結(jié)果表明，采用Kromasil C18色譜柱時(shí)，峰形和分離度較好，因此選用Kromasil C18色譜柱。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

精密稱取西瑞香素對(duì)照品5.00 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，得西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度分別為10，20，40，80，100 μg／mL的西瑞香素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用0.45 μm濾膜濾過，待用。分別吸取10 μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.4色譜條件下測(cè)定色譜峰面積，以西瑞香素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=51 388X+1 185.4，r2=0.999 9。結(jié)果表明西瑞香素質(zhì)量濃度在20～100 μg／mL內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取100 μg／mL的西瑞香素對(duì)照品溶液10 μL，在1.4色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算結(jié)果見表1。由表1可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.23%，說明該方法的精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，按照1.4色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，結(jié)果見表2。由表2可知，根皮中和塊根中西瑞香素測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7%，1.8%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取土圞兒根皮和塊根樣品各6份，按1.3方法制備后，在1.4色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，根皮中西瑞香素的含量為49.87 μg／g，塊根中的含量是4.97μg／g，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差分別為1.8%，2%，說明方法的重復(fù)性滿足檢測(cè)要求。

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的土圞兒根皮和塊根樣品約20 g，共6份，精密稱定。按照1.3方法制備后，分別加入適量的西瑞香素對(duì)照品溶液，在1.4色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可知，根皮和塊根樣品的加標(biāo)回收率分別為98.8%和98.2%。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

采用95%乙醇加熱回流提取工藝，建立了高效液相色譜法測(cè)定土圞兒中西瑞香素含量的分析方法。在選擇的條件下方法的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均能滿足分析檢測(cè)要求。該法簡(jiǎn)便、快捷，可用于土圞兒的質(zhì)量控制。

［1］ 尚志鈞.本草拾遺輯釋［M］.合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，2003.

［2］ 全國(guó)中草藥匯編編寫組.全國(guó)中草藥匯編［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994:47.

［3］ 胡軼娟，程林，浦錦寶，等.土圞兒石油醚萃取物的GC–MS分析［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41(12): 79–81.

［4］ 駱傳祖.《本草綱目》之土芋釋名考［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1998，9(3): 385–386.

［5］ 陳修源，陳修芬.《本草綱目拾遺》中土芋藤的考釋［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，6(4): 37.

［6］ 宋立人，洪徇，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典(上冊(cè))［ M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001: 110–111.

［7］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志第41 卷［M］.北京：科學(xué)出版社，1995: 200.

［8］ 胡軼娟，程林，浦錦寶，等.土圞兒石油醚萃取物的GC–MS分析［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41(12): 79–81.

［9］ 佟立今，鄭玲，張石，等.西瑞香素與大鼠血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30(2): 109–113.

［10］ 楊振宇，郭薇，吳東媛，等.了哥王中西瑞香素的提取分離及抗腫瘤作用研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20(3): 522–526.

［11］ 張立，喻文進(jìn)，劉慧瓊，等.西瑞香素抗炎抑菌作用的初步實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，18(6): 72–73.

［12］ 張國(guó)民，齊赤虹，柏萍，等.西瑞香素的心臟效應(yīng)［J］.中國(guó)中藥雜志，1993，18(12): 751–752.

［13］ Iwai K，Matsue H. Ingestion of Apios Americana Medikus tuber suppresses blood pressure and improve plasma lipids in spontaneously hypertensive rats［J］. Nutuition Research，2007，27(4): 218–224.

［14］ 郭君陽，郝桂彤，孫立新.了哥王中西瑞香素提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(9): 2 190–2 191.

Determination of Daphnoretin in Root Bark and Roof of Apios Fortunei Maxim by High Performance Liquid Chromatography

Huang Lujun, Wang Ranran, Xu Lingchuan
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355, China)

The method for determining daphnoretinin root bark and roof of apios fortunei maxim by high performance liquid chromatography was established. The separation was performed on Kromasil C18column (250 mm×4.6 mm，5μm) with methanol–0.2% phosphoric acid aqueous solution (55∶44) mobile phase, the fow rate was 1.0 mL／min. The column temperature was 35℃and the detection wavelength was 345 nm. The mass concentration of daphnoretinin was linear with chromatographic peak area in the range of 20–100 μg／mL, the correlation coeffcient was 0.999 9. The precision of the method (RSD) was 1.23%(n=6). The recovery of daphnoretinin root bark and roof were 98.8%, 98.2%, and the relative standard deviation were 1.3%, 2%(n=6), respectively. The method is accurate and rapid，and it can be used for the quality control of apios fortunei maxim.

apios fortunei maxim; daphnoretin; high performance liquid chromatography

O657.7

：A

：1008–6145(2017)01–0061–03

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.01.015

聯(lián)系人：黃陸軍；E-mail: 295684698@qq.com

2016–09–12