何少海，姚盛存，豐宇凱，汪 軻，李飛飛

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)bar基因轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷組織的研究

何少海，姚盛存，豐宇凱，汪 軻，李飛飛

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300）

為建立以草丁膦為選擇標(biāo)記的農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens介導(dǎo)的水稻Oryza sativa胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 bar基因?qū)肓?‘日本晴’Oryza sativa ‘Nipponbare’ ‘秀水134’ ‘Xiushui 134’和‘中花11’ ‘Zhonghua 11’等3個(gè)水稻品種的胚性愈傷組織。在分別以選擇壓15.0，10.0和10.0 mg·L-1的草丁膦質(zhì)量濃度進(jìn)行了3次選擇后，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）發(fā)現(xiàn) ‘日本晴’ ‘秀水134’和 ‘中花11’的愈傷組織轉(zhuǎn)化效率分別是77.9%，67.5%和92.2%，獲得的抗性愈傷組織可以進(jìn)一步分化成苗。它們的分化率依次是76.1%，44.4%和86.7%；成苗率分別為65.6%，66.7%和30.7%。在以草丁膦作為篩選標(biāo)記時(shí)，首選‘日本晴’作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。該體系為以抗除草劑基因作為篩選標(biāo)記的水稻遺傳轉(zhuǎn)化和基因功能驗(yàn)證提供了技術(shù)基礎(chǔ)，獲得的抗草丁膦轉(zhuǎn)化植株為水稻育種提供了材料。圖5表3參32

分子生物學(xué)；草丁膦；bar基因；胚性愈傷組織；粳稻；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化

草丁膦（glufosinate，PPT）又叫草銨膦，是一種低毒且廣譜性的有機(jī)磷類除草劑。它被植物吸收后，能有效抑制谷酰胺合成酶的活性，使銨在細(xì)胞里迅速積累，最后導(dǎo)致整個(gè)植物體死亡［1-2］。其抗性bar基因（bialaphos resistance gene）來(lái)自土壤吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus，它編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinthricin acetyltransferase，PAT），PAT能使PPT的氨基發(fā)生乙?；?，進(jìn)而解除PPT對(duì)植物的毒性［3］。因此，含有bar基因的植物對(duì)草丁膦除草劑具有一定的抗性［4］。將bar基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，不僅有效去除雜草，而且對(duì)施用作物無(wú)毒害。轉(zhuǎn)bar基因農(nóng)作物的培育和應(yīng)用受到育種者的廣泛重視［5-7］，轉(zhuǎn)抗草丁膦的油菜Brassica campestris和玉米Zea mays已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)［8］。水稻Oryza sativa是世界性的糧食作物，中國(guó)是世界上最大的水稻生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)。隨著雜交育種和分子輔助選擇育種技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，水稻產(chǎn)量不斷提高，品質(zhì)也得到了極大改良［9］。然而，目前仍有一些因素制約水稻生產(chǎn)。例如病蟲害和田間雜草等生物逆境以及一些旱災(zāi)等非生物逆境都會(huì)造成水稻嚴(yán)重的減產(chǎn)。特別是雜草不僅與水稻爭(zhēng)奪水分及養(yǎng)料，而且提高人工成本，已經(jīng)成為水稻生產(chǎn)上的一大難題［10］。bar基因不僅可以作為選擇標(biāo)記基因，而且能使水稻具有抗除草劑的優(yōu)良特征。轉(zhuǎn)bar基因水稻能有效除去雜草，大大減少勞動(dòng)力［11］。1996年美國(guó)對(duì)抗除草劑Liberty（草丁膦的商業(yè)名）轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行抗性鑒定試驗(yàn)，噴施Liberty后，雜草被有效控制，而轉(zhuǎn)基因水稻不受影響。與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)外開展了抗草丁膦基因轉(zhuǎn)化水稻的相關(guān)研究。于志華等［12］采用基因槍法獲得了抗bar基因旱稻植株，試圖解決旱稻田間直播的雜草問(wèn)題。CAO等［13］將bar基因作為篩選標(biāo)記，利用微粒轟擊法轉(zhuǎn)化水稻的懸浮細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化植株。PARK等［14］選用水稻莖尖分生組織作為轉(zhuǎn)化受體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，獲得幾棵轉(zhuǎn)基因植株，在后代中可以穩(wěn)定遺傳。黃大年等［15］用基因槍分別對(duì)水稻的幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選取20.0~40.0 mg·L－1的草丁膦進(jìn)行選擇，獲得6株轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)化效率很低。簡(jiǎn)玉瑜等［16］通過(guò)基因槍將蠶抗菌肽基因轉(zhuǎn)化發(fā)芽種胚、未成熟胚和愈傷組織3種組織，選用4.0 mg·L－1的Basta進(jìn)行抗性篩選，只有發(fā)芽種胚獲得5株抗性植株，分子檢測(cè)3株為陽(yáng)性株。許新萍等［17］用基因槍對(duì)水稻的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選取2.0~4.0 mg·L－1的Basta進(jìn)行選擇，并獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率為89.6%。CHEN等［18］用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì) ‘明恢63’的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，先用25.0 mg·L－1的Basta篩選8~9周后，再用20.0 mg·L－1的Basta選1次，獲得轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性率為70%。綜上所述，所選的受體部位是懸浮細(xì)胞、莖尖分生組織、幼胚、成熟胚和愈傷組織等，草丁膦的篩選質(zhì)量濃度為0.5~40.0 mg·L－1，沒有一個(gè)確定的轉(zhuǎn)化濃度。目前，以潮霉素作為選擇壓的水稻轉(zhuǎn)基因體系已經(jīng)非常成熟。但利用草丁膦作為篩選劑轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷組織的報(bào)道較少?；诖耍狙芯窟x取具有成功再生體系的 ‘日本晴’ ‘秀水134’ ‘中花11’的胚性愈傷組織作為受體，篩選出最適的草丁膦轉(zhuǎn)化質(zhì)量濃度，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將bar基因轉(zhuǎn)化這些水稻的胚性愈傷組織，獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻，建立以草丁膦為選擇壓的高效轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)選育生產(chǎn)中農(nóng)藝性狀良好的抗性品種提供轉(zhuǎn)基因材料。

1 材料和方法

1.1 材料

粳稻 ‘日本晴’Oryza sativa‘Nipponbare’ ‘中花11’Oryza sativa‘Zhonghua 11’和 ‘秀水134’Oryza sativa‘Xiushui 134’種子；具有草丁膦抗性的pKF111雙元載體；純度為99%草丁膦；EHA105農(nóng)桿菌菌株。

1.2 方法

1.2.1 胚性愈傷組織的誘導(dǎo) ‘日本晴’ ‘秀水134’和 ‘中花11’成熟種子用質(zhì)量濃度為30%次氯酸鈉表面消毒，無(wú)菌水洗滌2~3次，接種在胚性愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基R1［NB（N6培養(yǎng)基＋B5維生素）+ 2.5 mg·L－12.4-D+0.5 g·L－1脯氨酸+0.3 g·L－1水解酪蛋白+30 g·L－1蔗糖+4.0 g·L－1非特膠（phytalgel）上，15 d后種子表面出現(xiàn)少量的愈傷組織，挑取出來(lái)繼代在相同的培養(yǎng)基（2.4-D減為2 mg·L－1）上，胚性愈傷組織組織進(jìn)一步增殖，待用做轉(zhuǎn)化［19-20］。

1.2.2 3種胚性愈傷組織的草丁膦敏感性試驗(yàn)和水稻遺傳轉(zhuǎn)化 將誘導(dǎo)獲得的3種基因型胚性愈傷組織分別接種在含有0，5，10，15，20和50 mg·L－1草丁膦的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種25塊·培養(yǎng)皿－1大小均一的新鮮愈傷組織，3個(gè)重復(fù)，26℃培養(yǎng)25 d后，觀察胚性愈傷組織的死亡數(shù)，并統(tǒng)計(jì)死亡率，確定合適的草丁膦篩選濃度。將含有bar基因載體的農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)過(guò)夜，用菌液稀釋培養(yǎng)基R2（NB+500 mg·L－1脯氨酸+300 mg·L－1水解酪蛋白+30 g·L－1蔗糖+20 mg·L－1乙酰丁香酮）稀釋光密度值至0.6~0.8，侵染水稻的胚性愈傷組織15 min，期間不停晃動(dòng)，之后用濾紙吸干多余的菌液，放在鋪有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基R3（NB+500 mg·L－1脯氨酸+300 mg·L－1水解酪蛋白+30 g·L－1蔗糖+4.0 g·L－1phytalgel+20 mg·L－1乙酰丁香酮）上暗培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)后的胚性愈傷組織用含有500 mg·L－1頭孢霉素的無(wú)菌水洗2次，用濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)接抗性選擇培養(yǎng)基R4（NB+2 mg·L－12.4-D+500 mg·L－1脯氨酸+300 mg·L－1水解酪蛋白+500 mg·L－1谷氨酰胺+30 g·L－1蔗糖+4.0 g·L－1phytalgel+500 mg·L－1頭孢霉素+篩選出的合適草丁膦質(zhì)量濃度）上篩選3次。每15 d繼代1次。3輪選擇后挑取抗性愈傷組織系，進(jìn)行編號(hào)，并轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基R5（NB+0.5 mg·L－1NAA+3 mg·L－16-BA+500 mg·L－1脯氨酸+300 mg·L－1水解酪蛋白+500 mg·L－1谷氨酰胺+30 g·L－1蔗糖+4.0 g·L－1phytalgel）上進(jìn)行分化培養(yǎng)，同時(shí)提取抗性愈傷組織系的DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率。胚性愈傷組織出現(xiàn)的綠點(diǎn)進(jìn)一步分化出不定芽，待不定芽長(zhǎng)到2~3 cm，轉(zhuǎn)接在生根培養(yǎng)基R6（1/2 NB+20 g·L－1蔗糖+8.0 g·L－1瓊脂）上，待苗長(zhǎng)到10 cm，并有大量的根，移栽營(yíng)養(yǎng)缽成活后，再移至大田成活，收種。

1.2.3 抗性愈傷組織系和葉片的DNA提取和PCR分子檢測(cè) 利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取抗性愈傷組織系和再生植株葉片的DNA，用bar基因的引物（F：ACCATCGTCAACCACTACATCG，R：GCTGCCAGAAACCCACGTCAT）進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增的目的片段是430 bp。

1.2.4 T0代植株的田間草丁膦篩選 對(duì)照和轉(zhuǎn)基因的植株的展開葉片用棉球蘸取質(zhì)量濃度分別為50，100和300 mg·L－1的草丁膦，5 d后觀察葉片的變化。

2 結(jié)果和分析

2.1 3個(gè)水稻品種的愈傷組織對(duì)草丁膦抗性篩選

將 ‘日本晴’ ‘秀水134’和 ‘中花11’成熟胚誘導(dǎo)的米黃色且有光澤的胚性愈傷組織接種在分別含有6個(gè)質(zhì)量濃度的草丁膦的選擇培養(yǎng)基R4上，死亡率為50%~60%的愈傷組織對(duì)應(yīng)的草丁膦質(zhì)量濃度即可用作選擇的質(zhì)量濃度。結(jié)果如表1和圖1所示：3個(gè)水稻品種的胚性愈傷組織在空白對(duì)照上全部存活，且大量增殖；在5.0 mg·L－1草丁膦的選擇壓下，死亡率為19%~23%，發(fā)生褐變的愈傷組織數(shù)量較少，且大部分愈傷組織有明顯增殖，沒有起到篩選作用；隨著草丁膦質(zhì)量濃度的增加，在10.0 mg·L－1時(shí)， ‘秀水134’和 ‘中花11’2個(gè)品種死亡率為51%~56%，且與5.0 mg·L－1相比存在極顯著性差異，達(dá)到選擇效果； ‘日本晴’在15.0 mg·L－1下，死亡率54.53%，且與10.0 mg·L－1相比存在極顯著性差異，達(dá)到選擇效果；但 ‘日本晴’在20 mg·L－1下，死亡率60%以上，選擇效果偏大； ‘秀水134’和‘中花11’在15.0 mg·L－1下，死亡率為55%~60%，選擇效果偏大；而質(zhì)量濃度50.0 mg·L－1時(shí)，3個(gè)水稻品種死亡率達(dá)到90%以上，表明該質(zhì)量濃度已經(jīng)超過(guò)臨界質(zhì)量濃度，選擇壓力太大。綜上所述， ‘日本晴’的草丁膦選擇質(zhì)量濃度應(yīng)為15.0 mg·L－1， ‘秀水134’和 ‘中花11’的草丁膦選擇質(zhì)量濃度都為10.0 mg·L－1。

2.2 抗草丁膦bar基因轉(zhuǎn)化3個(gè)水稻品種和植株再生

用粳稻誘導(dǎo)出的米黃色且有光澤的胚性愈傷組織（圖2A）作為受體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化bar基因。將侵染后 ‘日本晴’ ‘秀水134’和 ‘中花11’的胚性愈傷組織分別在質(zhì)量濃度為15，10和10mg·L－1的草丁膦下進(jìn)行3次選擇培養(yǎng)。第1次選擇后胚性愈傷組織大部分出現(xiàn)褐變（圖2B）；第2次選擇后，部分愈傷組織不抗繼續(xù)褐化和變黑，部分周邊長(zhǎng)出新的抗性愈傷組織（圖2C）；挑取新生的愈傷組織系進(jìn)行第3輪選擇，出現(xiàn)增殖（圖2D），抗性愈傷組織系分化出綠點(diǎn)（圖2E），進(jìn)一步長(zhǎng)出幼葉（圖2F），待葉片伸長(zhǎng)到2~3 cm時(shí)，再生苗快速生根，獲得完整的再生植株（圖2G），移栽成活（圖2H）。從胚性愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化到獲得抗性胚性愈傷組織約2~3個(gè)月，抗性愈傷組織分化成苗約2個(gè)月。整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程需要4~6個(gè)月。

表1 3個(gè)水稻品種胚性愈傷組織在不同質(zhì)量濃度草丁膦的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后死亡率統(tǒng)計(jì)Table 1 Mortality statistics of three kinds of rice EC（embryogenic callus）cultured on mediums containing 0,5,10,15,20,50 mg·L-1glufosinate after 25 d

圖1 3個(gè)水稻品種的胚性愈傷組織對(duì)草丁膦的敏感性試驗(yàn)Figure 1 Sensitivity test of three cultivars of rice EC to glufosinate

圖2 水稻胚性愈傷組織為受體轉(zhuǎn)化到再生圖Figure 2 Figures of rice embryogenic callus from transformation to regeneration

2.3 轉(zhuǎn)化率、分化率和成苗率的比較

抗性選擇后， ‘日本晴’ ‘秀水134’和 ‘中花11’分別獲得86，40和90塊抗性愈傷組織系，提取這些抗性愈傷組織系的DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，分別有67，27和83塊愈傷組織系均擴(kuò)增出目的條帶，轉(zhuǎn)化率分別為77.9%，67.5%和92.2%（表2）。圖3A是 ‘日本晴’隨機(jī)選擇的10塊抗性愈傷組織的檢測(cè)圖，除了泳道8和13，均擴(kuò)增出和陽(yáng)性對(duì)照（泳道3）一樣的條帶，轉(zhuǎn)化率均達(dá)到67%以上。說(shuō)明篩選的草丁膦質(zhì)量濃度是適合轉(zhuǎn)化的質(zhì)量濃度，同時(shí)淘汰非抗性愈傷組織系，減少后續(xù)的繼代工作量。

將這些陽(yáng)性愈傷組織系進(jìn)行分化培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：3個(gè)水稻品種的分化能力是不同的。 ‘秀水134’分化綠點(diǎn)最少，分化能力最弱（圖4A），共12塊愈傷組織分化出綠點(diǎn)，分化率為44.4%； ‘中花11’（圖4B）有72塊愈傷組織系分化出綠點(diǎn)，分化率為86.7%； ‘日本晴’分化綠點(diǎn)最多，分化能力最強(qiáng)（圖4C），51塊愈傷組織系分化出綠點(diǎn)，分化率為76.1%（表2）。

表2 3個(gè)水稻品種的轉(zhuǎn)化率、分化率和出苗率比較Table 2 Transformation rate,differentiation rate and emergence rate in three rice genotypes

圖3 抗性愈傷組織系（A）和轉(zhuǎn)基因植株葉片（B）的PCR檢測(cè)圖Figure 3 Detection of bar gene in glyphosate-resistant EC lines by PCR analysis

2.4 轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)結(jié)果

對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株葉片提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以bar基因引物引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 ‘日本晴’‘秀水134’和 ‘中花11’分別獲得120株，20株和60株轉(zhuǎn)基因小植株，其中bar基因陽(yáng)性株有99株、15株和52株，陽(yáng)性率為82.5%，75%和86.7%（表2）。圖3B為部分轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)結(jié)果。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的草丁膦抗性鑒定結(jié)果

對(duì)移栽成活的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行草丁膦抗性檢測(cè)，將蘸有不同質(zhì)量濃度草丁膦的棉球粘附在轉(zhuǎn)基因水稻的葉片上，5 d后，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)了明顯不同的反應(yīng)。圖5是 ‘日本晴’葉片在低質(zhì)量濃度為50.0 mg·L－1草丁膦處理時(shí)，未轉(zhuǎn)化植株葉片上出現(xiàn)枯黃的斑點(diǎn)，在100.0 mg·L－1草丁膦處理后，出現(xiàn)較大面積枯黃的斑，在高質(zhì)量濃度300.0 mg·L－1草丁膦處理后大面積變枯且嚴(yán)重灼傷。 但轉(zhuǎn)基因水稻葉片在50.0，100.0和300.0 mg·L－1草丁膦處理后仍無(wú)變化，表明轉(zhuǎn)基因水稻抗性提高了約6倍。

‘日本晴’ ‘秀水134’和 ‘中花11’分別獲得的99株、15株和52株P(guān)CR陽(yáng)性株，其中分別有10株、5株和12株的葉片變黃枯，其余均表現(xiàn)綠色，草丁膦陽(yáng)性率分別為89.9%，66.7%和76.9%（表3），轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出草丁膦抗性。

表3 bar轉(zhuǎn)基因植株抗性鑒定分析Table 3 Glufosinate-resistant analysis of transgenic plants

3 討論

3.1 水稻遺傳轉(zhuǎn)化中草丁膦篩選質(zhì)量濃度的確定和轉(zhuǎn)化效率

轉(zhuǎn)基因水稻的獲得依賴于篩選體系的選擇效果。 bar基因常作為選擇標(biāo)記基因，具有草丁膦抗性，除了選擇效率高外，還可以帶來(lái)抗除草劑的農(nóng)藝性狀。將bar基因或與其他目的基因串聯(lián)在一起轉(zhuǎn)化水稻，獲得抗草丁膦水稻。確定一個(gè)合適的草丁膦篩選質(zhì)量濃度，是提高轉(zhuǎn)化效率和優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同基因型水稻的胚性愈傷組織對(duì)草丁膦具有明顯不同的抗性。為了確定以胚性愈傷組織為受體最佳的草丁膦選擇質(zhì)量濃度，本研究選取了5個(gè) 5.0，10.0，15.0，20.0和50.0 mg·L－1草丁膦質(zhì)量濃度梯度，對(duì) ‘日本晴’ ‘秀水134’和 ‘中花11’的胚性愈傷組織進(jìn)行草丁膦敏感試驗(yàn)，并確定有效的抗性篩選草丁膦質(zhì)量濃度分別為15.0，10.0和10.0 mg·L－1（圖1），轉(zhuǎn)化效率分別為77.9%，67.5%和92.2%，達(dá)到了一個(gè)很好的選擇效果。本研究為以不同的水稻胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，提供可靠的草丁膦選擇質(zhì)量濃度。選取合適質(zhì)量濃度的草丁膦進(jìn)行選擇，是成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵之一。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株葉片草丁膦抗性檢測(cè)Figure 5 Glufosinate-resistant analysis of the leaves for transgenic plants

3.2 3個(gè)水稻品種分化率和再生效率的比較

‘日本晴’ ‘秀水134’和 ‘中花11’的3個(gè)水稻品種均能獲得成功的再生和轉(zhuǎn)化體系，是目前水稻轉(zhuǎn)基因常用的受體材料。本研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)以草丁膦為選擇標(biāo)記時(shí)，它們的分化效率是不同的。其中‘中花11’的分化能力最強(qiáng)，分化率最高，高達(dá)86.7%； ‘秀水134’的分化能力最差，分化率只有44.4%； ‘日本晴’介于兩者之間，分化率為76.1%。同時(shí)也對(duì)它們的再生效率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，研究發(fā)現(xiàn)，‘日本晴’有51個(gè)愈傷組織系分化，分化出183綠點(diǎn)，成苗數(shù)是120株，成苗率是65.6%； ‘秀水134’有12個(gè)愈傷組織系分化，分化出30綠點(diǎn)，成苗數(shù)20株，成苗率是66.7%； ‘中花11’有72個(gè)愈傷組織系分化，分化出195綠點(diǎn)，成苗數(shù)60株，成苗率是30.7%。 ‘中花11’分化率最高，成苗率最低；‘日本晴’的分化率居中， ‘秀水134’的分化率最低； ‘日本晴’和 ‘秀水134’的成苗率基本一樣高。據(jù)此，當(dāng)以草丁膦作為篩選標(biāo)記時(shí)，首選 ‘日本晴’作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

3.3 以胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體的轉(zhuǎn)化植株的變異率問(wèn)題的解決

水稻轉(zhuǎn)基因除了常用的基因槍法［21-23］，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也是目前一種可行有效的方法。用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的胚性愈傷組織，可以減少嵌合體，提高轉(zhuǎn)化效率［24-30］，但是仍然出現(xiàn)一些再生植株的變異問(wèn)題。例如多分蘗，無(wú)花粉等［31］。采取以下措施：①縮短抗性選擇時(shí)間，加強(qiáng)分化選擇力度。經(jīng)過(guò)1次抗性選擇，進(jìn)行分化培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基上加入減半的草丁膦質(zhì)量濃度，直到分化出綠點(diǎn)為止。②選用最新誘導(dǎo)出的、有光澤、淡黃色的胚性愈傷組織，剛從愈傷組織誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織，及時(shí)挑出，增殖一定數(shù)量，用于轉(zhuǎn)化［32］；③減少繼代次數(shù)。從轉(zhuǎn)化到獲得再生苗約4~5個(gè)月，期間繼代5~6次；統(tǒng)計(jì)再生植株的變異率低于20%。本研究通過(guò)對(duì)水稻草丁膦敏感實(shí)驗(yàn)，成功建立了以草丁膦為篩選標(biāo)記的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷組織的體系。整個(gè)轉(zhuǎn)化周期 4~6個(gè)月。獲得抗300 mg·L－1草丁膦的 T0轉(zhuǎn)基因植株。該體系為以除草劑作為選擇壓的水稻遺傳轉(zhuǎn)化提供了技術(shù)支持，獲得的抗草丁膦水稻為水稻育種提供了材料。

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Transformation of the bar gene into embryogenic calli of rice via Agrobacterium tumefaciens

HE Shaohai，YAO Shengcun，F(xiàn)ENG Yukai，WANG Ke，LI Feifei
（The Key Laboratory for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province，School of Agriculture and Food Science， Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

To establish the embryogenic calli（EC）transformation system of rice with Basta as a selectable agent,the glufosinate-resistant gene （bar gene）was transformed into EC of rice cultivars, ‘Nipponbare’,‘Xiushui 134’ and ‘Zhonghua 11’ by Agrobacterium-mediated transformation.After 3 cycles of glufosinate-resistant screening with 15,10 and 10 mg·L-1glufosinate,transgenic EC was detected by PCR.The transformation efficiency of ‘Nipponbare’,‘Xiushui 134’ and ‘Zhonghua 11’ was 77.9%，67.5%and 92.2%respectively.The results showed that the selectable concentrations were effective for resistant EC screening and the resistant EC subsequently differentiated into seedlings.The frequency of EC differentiation of‘Zhonghua 11’ was 86.7%and the seedling rate was 30.7%;the frequency of EC differentiation of‘Xiushui 134’ was 44.4%,and the seedling rate was 66.7%;the frequency of EC differentiation of‘Nipponbare’ was 76.1%;and the seedling rate was 65.6%.Therefore,of the 3 cultivars,the EC of‘Nipponbare’ for genetic transformation with glufosinate as a selectable agent was most efficient.The glufosinate selection transformation system not only provides a technical basis for rice genetic transformation and functional validation,but also provides transgenic materials with herbicide resistance for rice breeding.［Ch,5 fig.3 tab.32 ref.］

molecular biology;glufosinate;bar gene;embryogenic calli（EC）;Oryza sativa;Agrobacterium-mediated transformatiom

S511；Q785

A

2095-0756（2017）01-0129-08

2016-02-22；

2016-05-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（31401461）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（新苗人才計(jì)劃）項(xiàng)目（2015R412002）；2015年浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

何少海，從事水稻轉(zhuǎn)基因研究。E-mail：642836550@qq.com。通信作者：李飛飛，副教授，從事植物基因工程研究。E-mail：lifei-fei@163.com

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2017，34（1）：137-144

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019