白葉1號的低溫抗逆特性分析

張?zhí)m，李鑫，魏吉鵬,2，李治鑫,2，沈晨,2，顏鵬，張麗平，韓文炎*

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白葉1號的低溫抗逆特性分析

張?zhí)m1，李鑫1，魏吉鵬1,2，李治鑫1,2，沈晨1,2，顏鵬1，張麗平1，韓文炎1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，浙江杭州310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081

比較了浙江省白化品種白葉1號返白階段和主栽品種龍井43的低溫抗性。結(jié)果表明，常溫（25℃）環(huán)境下，返白期白葉1號反映光合能力的凈光合速率Pn和最大羧化反應效率Vcmax都只有龍井43的70%~80%，而APX、POD等抗氧化酶活力比龍井43高30%以上。低溫（2℃）處理24?h后，白葉1號反映光合能力的各項參數(shù)反而高于龍井43，同時其APX、POD、SOD活性也比龍井43分別高38.9%、33.3%、23.3%。說明白葉1號可能由于白化現(xiàn)象的產(chǎn)生，導致其抗氧化系統(tǒng)修復能力得到提高，因此在低溫脅迫中，能夠更為有效地清除葉片H2O2累積，緩解H2O2造成的氧化脅迫及光合抑制現(xiàn)象，具備比龍井43更好的低溫耐受性。

白葉1號；返白；低溫脅迫；抗氧化酶

白葉1號（cv.）是一種低溫敏感型的茶樹白化變異品種，其新梢發(fā)育過程中存在階段性返白現(xiàn)象。成浩等[1]研究發(fā)現(xiàn)，白葉1號的返白現(xiàn)象主要受當年春季氣溫的影響并只在茶芽萌動期表現(xiàn)。在浙江杭州地區(qū)，白葉1號的白化時間一般從4月3日持續(xù)到4月27日，新葉顏色表現(xiàn)出淺綠色-乳白色-全白色的變化過程[2]。白葉1號的白化現(xiàn)象與品質(zhì)正相關(guān)，在近25?d的白化現(xiàn)象發(fā)生期間，其一芽二葉的氨基酸含量比普通綠茶高1倍，但茶多酚含量僅為普通綠茶的1/2，故其滋味鮮爽、風味獨特，正因此白葉1號茶深得消費者的喜愛及研究者的關(guān)注。研究表明，白葉1號葉色白化突變產(chǎn)生的機制非常復雜，受溫度、光照等外界環(huán)境因素和基因、蛋白變化等內(nèi)在因素的共同影響[3-4]。在多種調(diào)控途徑和代謝過程發(fā)生變化的情況下，白葉1號的抗逆性是否受影響，是目前值得進一步探究的科學問題。

白葉1號春芽萌動至返白期間正是“倒春寒”天氣易發(fā)生的時期（春季后期，一般4月）?！暗勾汉边@種低溫天氣常對茶樹的生長發(fā)育產(chǎn)生嚴重影響，致使剛萌發(fā)的春茶嫩芽被凍傷或凍死。光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，直接反映植物的生長狀況，并且是受低溫影響最明顯的過程之一[5]。低溫通常會造成茶樹光合系統(tǒng)的損傷[6]，引起茶樹細胞膜半透性的改變或喪失，細胞內(nèi)的物質(zhì)大量滲透，最終導致細胞死亡[7]，嚴重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[8-9]。因此，結(jié)合生產(chǎn)實踐，本研究以浙江一帶主栽常規(guī)優(yōu)質(zhì)品種——龍井43為對照，以光合作用能力和抗氧化酶系統(tǒng)等為切入點，初步探討了白葉1號返白階段對低溫脅迫的抗性響應，同時為白葉1號返白期的抗逆性研究提供數(shù)據(jù)積累。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

采用中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所玻璃溫室培養(yǎng)的龍井43及白葉1號二年扦插苗為試驗材料，于4月中旬白葉1號葉片返白期進行試驗處理。取長勢一致的兩品種茶苗放入25℃的人工氣候培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)1?d，光照強度600?μmol·m-2·s-1，光周期12?h，晝夜溫度25℃/17℃，濕度70%；之后各取一半數(shù)量的兩品種茶苗放入低溫（晝夜溫度均為2℃）人工氣候培養(yǎng)箱中處理，光照、光周期、濕度條件同上，24?h后對兩個溫度下的茶苗取樣并進行相關(guān)指標的測定。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 光合氣體交換

利用LI-COR 6400xt型便攜式光合熒光測量系統(tǒng)在光照強度為600?μmol·m-2·s-1和CO2物質(zhì)的量分數(shù)為400?μmol·mol-1下測定茶樹葉片的凈光合速率（Pn）及光合CO2響應曲線（）[10]。根據(jù)CO2響應曲線數(shù)據(jù)，參考Ethier等[11]的方法分析Rubisco最大羧化速率（Vcmax）及RuBP最大再生速率（Jmax）。

1.2.2 葉綠素熒光參數(shù)

利用IMAGING-PAM調(diào)制熒光成像系統(tǒng)測定熒光參數(shù)——最大光化學量子產(chǎn)量（Fv/Fm）。將測量光、光化光、飽和光的光強分別設定為<0.05、280、4 000?μmol·m-2·s-1。茶樹植株暗適應20~30?min后開始測定。先獲得暗適應下葉片的最小熒光Fo，然后打開飽和脈沖光（0.8?s）獲得暗適應下葉片的最大熒光Fm。參數(shù)的計算根據(jù)Snel等[12]方法，具體計算公式如下：Fv/Fm=（Fm－Fo）/Fm。

1.2.3 DAB染色

將茶樹葉片放入0.1%二甲基聯(lián)苯胺（DAB）溶液中并置于25℃環(huán)境中光照4~6?h，待葉片上開始出現(xiàn)褐紅色斑點即染色完畢。將葉片取出放置在95%乙醇中，沸水浴約15?min，更換95%乙醇再次沸水浴直至將葉片完全脫綠，保存到95%乙醇中后拍照。

1.2.4 抗氧化酶活性測定

提取方法：取0.3?g茶樹液氮凍樣，研缽磨成粉末，加3?mL磷酸緩沖液（50?mmol·L-1PBS，含0.2?mmol·L-1EDTA和2% PVP）提取，4℃，12 000?g，離心20?min，取上清液用于以下酶活性的測定。

抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定采用Nakano等[13]的方法，并有所改進。2?mL反應液中含1?700?μL 25?mmol·L-1PBS緩沖液(pH 7.0，含0.1?mmol·L-1EDTA)，100?μL 5?mmol·L-1AsA，100?μL酶液及100?μL 20?mmol·L-1H2O2，立刻測定OD290的動力學變化，測定時間間隔為40?s。

過氧化氫酶（CAT）活力測定參照Cakmak等[14]的方法，并有所改進。2?mL反應液中含1?700?μL的25?mmol·L-1PBS（pH 7.0，含0.1?mmol·L-1EDTA），100?μL酶液及200?μL 10?mmol·L-1H2O2，在25℃下反應，并立刻測定OD470的動力學變化，測定時間間隔為40?s。

超氧化物歧化酶（SOD）活力測定采用Giannopolitis等[15]的方法，并有所改進。3?mL反應混合液中含50?mmol·L-1PBS（pH 7.8，含甲硫氨酸，NBT，核黃素及0.1?mmol·L-1EDTA），加入酶液50?μL。在25℃，光強100?μmol·m-2·s-1下光照10?min，然后置于黑暗環(huán)境中終止反應，測定OD560的吸光值。

過氧化物酶（POD）活力測定參照Cakmak等[14]的方法，并有所改進。2?mL反應液中含1?700?μL 25?mmol·L-1PBS緩沖液（pH 7.0，含0.1?mmol·L-1EDTA），100?μL酶液，100?μL 20?mmol·L-1H2O2及100?μL 1%愈創(chuàng)木酚，在25℃下反應，并立刻測定OD470的動力學變化，測定時間間隔為40?s。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010進行數(shù)據(jù)平均數(shù)、方差的計算，SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行顯著性差異分析，Origin7.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對龍井43和白葉1號凈光合速率的影響

凈光合速率（Pn）是反映植株葉片光合強度的最主要指標[16]，可以從一個側(cè)面反映植株的生長活性。由圖1所示，正常生長溫度下，白葉1號和龍井43的凈光合速率分別為4.50?μmol·m-2·s-1和5.65?μmol·m-2·s-1，白葉1號的凈光合速率顯著低于龍井43，僅為龍井43凈光合速率的79.6%。但是低溫脅迫處理24?h以后，龍井43的凈光合速率為1.82?μmol·m-2·s-1，下降至常溫水平的32.2%，而白葉1號的凈光合速率為2.56?μmol·m-2·s-1，為常溫水平的56.90%。低溫脅迫后，白葉1號的凈光合速率反而比龍井43高出40.7%。

注：圖中不同字母代表不同處理間差異顯著，P<0.05，下同。

2.2 低溫對龍井43和白葉1號Fv/Fm的影響

葉綠素熒光被稱為“光合作用的探針”，幾乎所有光合作用過程的變化都可以通過葉綠素熒光反映出來，其中暗適應下PSⅡ的最大光化學量子產(chǎn)量Fv/Fm是植物對外界響應的重要參數(shù)[17]。圖2-A為茶樹葉片F(xiàn)v/Fm的熒光成像，標尺上不同顏色對應著不同的數(shù)值，茶樹葉片顏色的變化即反映著其Fv/Fm數(shù)值的變化，根據(jù)熒光成像結(jié)果的數(shù)字化分析獲得圖2-B。我們發(fā)現(xiàn)，正常溫度下生長的龍井43與白葉1號的最大光化學量子產(chǎn)量Fv/Fm沒有顯著差異，分別為0.78、0.77。低溫處理24?h后，龍井43葉片的Fv/Fm迅速降低至0.49，而白葉1號的Fv/Fm為0.66，與常溫相比也有所下降，但比龍井43高約34.7%。以上結(jié)果說明，低溫對白葉1號造成的光抑制程度要低于龍井43。

2.3 低溫對龍井43和白葉1號Vcmax和Jmax的影響

植物葉片的Vcmax反映卡爾文循環(huán)中由1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）催化的最大羧化反應效率，Jmax是指在光合循環(huán)中1,5-二磷酸核酮糖（RuBP）產(chǎn)物的最大再生速率[18]。Rubisco是光合作用中重要的酶系統(tǒng)[19]，研究發(fā)現(xiàn)，常溫環(huán)境下龍井43的Vcmax為23.6?μmol·m-2·s-1，白葉1號的Vcmax為18.1?μmol·m-2·s-1，即白葉1號葉片中Rubisco最大羧化速率約為龍井43的76.7%。但低溫處理后，白葉1號的Vcmax卻顯著高于龍井43，二者分別為13.9?μmol·m-2·s-1和10.4?μmol·m-2·s-1（圖3-A）。分析RuBP最大再生速率發(fā)現(xiàn)，不論是常溫還是低溫處理，白葉1號與龍井43的Jmax均沒有顯著差異（圖3-B）。

2.4 低溫對龍井43和白葉1號葉片中H2O2含量的影響

當植物受高溫、低溫、機械損傷及病原菌等脅迫后，組織內(nèi)活性氧（ROS，Reactive oxygen species）產(chǎn)生和清除之間的平衡會受到干擾，導致ROS水平急速上升[20]，從而造成植物的氧化脅迫。過氧化氫（H2O2）是一類重要的ROS，通過DAB染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常溫環(huán)境下，白葉1號與龍井43葉片中的H2O2含量沒有顯著差異，但經(jīng)低溫處理后，龍井43葉片沿葉脈出現(xiàn)了大面積的黃褐色H2O2聚集區(qū)域，而白葉1號葉片只呈現(xiàn)淡黃色（圖4）。這說明低溫對龍井43造成的氧化脅迫程度要強于白葉1號。

圖4 低溫對龍井43和白葉1號葉片H2O2含量的影響

2.5 低溫對龍井43和白葉1號抗氧化酶系統(tǒng)的影響

H2O2等活性氧是植物細胞各種代謝途徑產(chǎn)生的副產(chǎn)物，在正常條件下會被特定組織的抗氧化防御機制清除[21]，主要包括抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化物酶（POD）等。試驗結(jié)果（圖5）表明，正常溫度下白葉1號葉片中的APX、POD活性都顯著高于對照龍井43，分別提高了34.1%、38.1%（圖5-A、5-D）。經(jīng)過低溫處理24?h后，白葉1號葉片中APX、SOD、POD（圖5-A、5-C、5-D）的活性均顯著高于龍井43，三者分別提高38.9%、23.3%及33.3%。這說明，無論在常溫條件下還是在低溫脅迫后，白葉1號都具有較強的抗氧化能力。

3 討論

根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們可以看到常溫（25℃）條件下，返白期白葉1號反映植物光合能力的凈光合速率（Pn）和最大羧化反應效率（Vcmax）都只有龍井43的70%~80%，而APX、POD等抗氧化酶活力都比龍井43高30%以上，表明白葉1號返白期的光合能力不如龍井43，但其抗氧化系統(tǒng)的修復能力卻比龍井43強。在受到低溫脅迫以后，反映白葉1號光合能力的各項參數(shù)指標反而高于龍井43，表明白葉1號在低溫脅迫中受到的損傷程度要低于龍井43。

體驗性營銷包括先經(jīng)歷過——獲得娛樂的體驗——表達的欲望——傳遞了愉悅的基本流程。其中情緒和情感是研究的重點。

白化是植物葉色突變體的常見類型之一，其最典型的特征是葉綠體不能正常發(fā)育[22]。在白葉1號新梢返白期間，其葉綠體結(jié)構(gòu)退化，片層結(jié)構(gòu)破壞，葉綠素合成受抑制，從而導致葉綠素含量降低，沒有完整的色素蛋白復合體[23-24]。李素芳等[25]研究發(fā)現(xiàn)，白葉1號葉片中的RuBP羧化酶大小亞基含量和活性在返白期間也會降低。葉片的色素蛋白復合體是植物捕獲光能，并把能量迅速傳至光化學反應中心，啟動光合作用的一類蛋白復合體；RuBP羧化酶則是光合作用C3反應中重要的羧化酶，因此二者含量及活性的下降直接抑制了白葉1號在正常溫度下的凈光合速率（圖1、圖3-A）。Deng[26]研究葉色突變植物——金邊龍舌蘭發(fā)現(xiàn)，其葉片白化區(qū)域的H2O2含量及SOD、CAT、APX的活性都顯著低于綠色正常區(qū)域；玉米葉片底部含葉綠素少的葉片中，其SOD、POD及CAT的含量卻顯著高于上部綠色葉片[27]，說明植物葉片抗氧化酶活性與葉綠素含量存在緊密的聯(lián)系。我們的研究發(fā)現(xiàn)，常溫環(huán)境下返白階段的白葉1號APX和POD的活性同樣高于龍井43品種（圖5-A、5-D）。植物的抗氧化酶系統(tǒng)是維持植物組織內(nèi)部ROS平衡，保護其在低溫、高溫、干旱、鹽害、重金屬等逆境脅迫下細胞結(jié)構(gòu)和功能免受傷害的重要防御機制[28]，抗氧化酶活性的高低通常作為植物非生物脅迫抗性強弱的重要評判指標。比較低溫條件下的白葉1號和龍井43的抗氧化酶活性發(fā)現(xiàn)，白葉1號葉片中APX、SOD及POD酶活都顯著高于龍井43（圖5-A、5-C、5-D），繼而有效減少低溫條件下葉片中H2O2的累積（圖4），降低H2O2對細胞膜系統(tǒng)、葉綠體超微結(jié)構(gòu)[29]及Rubisco分子結(jié)構(gòu)的損傷與破壞[30]。因此，返白階段的白葉1號與龍井43相比，其光合作用受低溫抑制較弱，經(jīng)低溫處理24?h后，仍具有較高的凈光合速率（圖1）、最大光化學量子產(chǎn)量（圖2）和Rubisco羧化速率（圖3-A）。因此試驗得出初步結(jié)論：返白階段的白葉1號因具有較高活性的抗氧化酶系統(tǒng)，而使其低溫抗性明顯高于龍井43。

值得注意的是，常溫下返白期白葉1號具有高活性的抗氧化酶，但葉片中并沒有明顯的H2O2積累。此時，H2O2是否作為植物體內(nèi)非常重要的次級信號分子[31]，參與白葉1號的返白現(xiàn)象或者其代謝和品質(zhì)調(diào)控也是值得深入研究的科學問題。

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Analysis of the Cold Resistance of Baiye 1

ZHANG Lan1, LI Xin1, WEI Jipeng1,2, LI Zhixin1,2, SHEN Chen1,2, YAN Peng1, ZHANG Liping1, HAN Wenyan1*

1. Tea Research Insititute, Chinese Academy of Agricultural Science, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

The cold resistance was compared in two cultivars, the albino Baiye 1 (cv.) during albinism period and Longjing 43 (cv.) in Zhejiang province. The results showed that the net photosynthesis rate (Pn) and maximum carboxylation rate of Rubisco (Vcmax) in Baiye 1 during the albinism period were only 70%-80% of those in Longjing 43, but the activities of antioxidant enzymes APX and POD were both 30% higher than those in Longjing 43 under normal temperature. However, when they were treated under 2℃ condition for 24?h, various parameters related to photosynthesis were higher in Baiye 1 than Longjing 43. The activities of APX, POD and SOD were also 38.9%, 33.3% and 23.3% higher in Baiye 1. All the results indicated that the albinism phenomenon of Baiye 1 may lead to the improvement of antioxidant system, which would effectively reduce the H2O2accumulation in tea leaves and alleviate oxidative damage and photosynthetic inhibition during cold stress. Therefore, Baiye 1 during albinism period may have a better cold resistance than Longjing 43.

Baiye 1, albinism, cold stress, antioxidant enzymes

S571.1；P423

A

1000-369X（2017）01-071-07

2016-08-01

2016-10-17

中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程資助

張?zhí)m，女，碩士，研究實習員，主要從事茶樹栽培與生理生化研究。