趙寶磊，劉運(yùn)超，陳玉梅，姬鵬超，王聚財(cái)，劉 暢，楊素珍，張改平,*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表達(dá)與反應(yīng)原性分析

趙寶磊1，劉運(yùn)超2，陳玉梅2，姬鵬超2，王聚財(cái)1，劉 暢2，楊素珍2，張改平1,2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

為了高效可溶性表達(dá)O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性優(yōu)化合成VP0和VP1基因片段，并將其克隆到pE-SUMO載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒SUMO-VP0和SUMO-VP1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化誘導(dǎo)溫度、時間和IPTG濃度等表達(dá)條件。結(jié)果顯示， SUMO-VP0可溶性蛋白表達(dá)的最佳條件為：20 ℃條件下，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)8 h；SUMO-VP1可溶性蛋白表達(dá)的最佳條件為：37 ℃條件下，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12 h。 SDS-PAGE電泳和Western blot結(jié)果表明，表達(dá)的SUMO-VP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能夠被抗FMDV的陽性血清識別，具有很好的反應(yīng)原性。

口蹄疫病毒； VP0、VP1結(jié)構(gòu)蛋白； 可溶性表達(dá)； SUMO標(biāo)簽

口蹄疫病(foot and mouth disease,FMD)是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)引起，主要感染牛、豬、羊等多種偶蹄動物[1]。血清學(xué)試驗(yàn)和交叉保護(hù)性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV主要存在7個血清型：A型、C型、O型、亞洲Ⅰ型、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南非Ⅲ型。這7個血清型之間沒有交叉保護(hù)，且遺傳變異頻率非常高，流行范圍非常廣泛，給世界上許多國家的畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，免疫接種疫苗是防控該病的主要措施，接種的主要疫苗是弱毒苗和滅活苗，雖然這些疫苗具有很好的保護(hù)效果，但是制備成本高，還存在滅活不完全導(dǎo)致病毒暴發(fā)流行的危險。因此，對這2種疫苗的使用存在爭議，迫切需要研究一種安全、高效、廉價的新型基因工程亞單位疫苗[3]。

FMDV為單股正鏈小RNA病毒，基因組全長有8 500個核苷酸，基因分為3個主要區(qū)域：5′UTR區(qū)、ORF區(qū)和3′UTR區(qū)。ORF區(qū)大約有7 000 nt，主要編碼L蛋白、P1結(jié)構(gòu)蛋白和P2、P3非結(jié)構(gòu)蛋白。P1結(jié)構(gòu)蛋白在后期的病毒翻譯和修飾過程中被3Cpro蛋白酶裂解為3個主要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP1和VP3。在病毒粒子的裝配過程中，VP0、VP1和VP3先形成5S聚集體再形成14S顆粒體，最后由12個14S顆粒體組裝成75S病毒的空殼蛋白體。VP1高度保守區(qū)的G-H環(huán)(140—160位)包含有精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸序列(RGD)，這些序列暴露在病毒粒子表面，構(gòu)成病毒的細(xì)胞吸附位點(diǎn)[4]。VP0被3Cpro蛋白酶進(jìn)一步裂解為VP2和VP4，VP4位于衣殼內(nèi)部主要與核心RNA相連，是決定病毒抗原性的主要成分。另外，VP2和VP4經(jīng)細(xì)胞激酶磷酸化后使FMDV的衣殼不穩(wěn)定有利于核酸脫殼。VP2和VP1蛋白上含有多種具有免疫原性的抗原決定簇，是機(jī)體內(nèi)中和性抗體結(jié)合病毒的靶標(biāo)。因此，VP0和VP1結(jié)構(gòu)蛋白成為亞單位疫苗研究的熱點(diǎn)，但目前關(guān)于體外可溶性表達(dá)具有生物學(xué)活性的VP0和VP1結(jié)構(gòu)蛋白的報(bào)道較少。

pE-SUMO載體是一種原核表達(dá)載體，主要用于促進(jìn)重組蛋白質(zhì)的正確折疊和增加蛋白質(zhì)的水溶性。載體內(nèi)含組氨酸標(biāo)簽和SUMO蛋白標(biāo)簽，這2種標(biāo)簽與目的蛋白融合表達(dá)不僅可以增加蛋白質(zhì)的可溶性，還可以增加蛋白質(zhì)的折疊效率[5-6]。鑒于此，采用pE-SUMO原核表達(dá)載體對FMDV VP0和VP1蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，以期獲得表達(dá)量較高的可溶性重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1，為FMDV VP0和VP1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及FMDV動物疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體、質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109和BL21(DE3)基因工程菌均購自TaKaRa公司。pE-SUMO原核表達(dá)載體和抗FMDV的陽性血清由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

核酸Marker DL2000、ExTaqDNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker和T4 DNA連接酶等為TaKaRa公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自O(shè)MEGA公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BsaⅠ購自NEB公司；抗組氨酸標(biāo)簽單抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗及HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗均購自Abcam公司；IPTG購自INALCO公司；AEC顯色試劑盒購自中杉公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與FMDVVP0和VP1基因合成

豬O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP0和VP1基因序列經(jīng)優(yōu)化后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,設(shè)計(jì)引物(表1)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述基因。

表1 VP0和VP1基因的PCR擴(kuò)增引物

注：下劃線位置為酶切位點(diǎn)。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以合成的O型FMDV的VP0和VP1基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL：ExTaq12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，加滅菌水補(bǔ)齊25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，循環(huán)32次；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，通過膠回收試劑盒回收目的基因。用BsaⅠ和XhoⅠ對目的基因VP0、VP1和pE-SUMO載體進(jìn)行雙酶切并回收，隨后用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。采用CaCl2轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞JM109中，對經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為SUMO-VP0和SUMO-VP1，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21中用于重組蛋白的表達(dá)。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與Western blot鑒定

分別將SUMO-VP0和SUMO-VP1陽性重組表達(dá)菌按1∶100的比例接種到含有Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)菌體，當(dāng)菌液的OD600=0.6時加入終濃度為0.1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，轉(zhuǎn)至25 ℃振蕩培養(yǎng)8 h。12 000 r/min離心15 min，棄上清，菌體沉淀用PBS緩沖液重懸后用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎。破碎后的液體12 000 r/min離心20 min。分別取40 μL的沉淀和上清,加入10 μL的5×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10 min，煮沸后的樣品用12%的SDS-PAGE檢測。通過電轉(zhuǎn)儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上進(jìn)行Western blot檢測。轉(zhuǎn)移后的NC膜置于5%脫脂奶中，4 ℃封閉過夜，用抗組氨酸標(biāo)簽單抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，再用1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗37 ℃孵育45 min，最后用AEC顯色試劑盒顯色并觀察分析顯色結(jié)果。

1.6 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

分別將SUMO-VP0和SUMO-VP1的陽性菌接種于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，分別對誘導(dǎo)表達(dá)時間、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和誘導(dǎo)表達(dá)溫度等進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)OD600=0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，在25 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在誘導(dǎo)后的4、6、8、10、12 h收集菌液；在誘導(dǎo)溫度25 ℃條件下，分別在0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)8 h收集菌液；在誘導(dǎo)劑濃度為0.5 mmol/L時，分別在16、20、25、37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)8 h收集菌液。分別將上述收集的菌液經(jīng)12 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體沉淀用PBS緩沖液重懸后用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎。破碎后的液體12 000 r/min離心20 min，分離沉淀和上清，分別用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳鑒定。通過對各種條件的優(yōu)化，選擇最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.7 Western blot檢測重組蛋白的反應(yīng)原性

將誘導(dǎo)表達(dá)得到的重組蛋白電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，在5%的脫脂奶中4 ℃封閉過夜。用抗O型FMDV的陽性血清以1∶200稀釋后作為一抗，37 ℃孵育1 h，再用1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗37 ℃孵育45 min，用AEC顯色試劑盒顯色并觀察顯色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1VP0和VP1基因的PCR擴(kuò)增

分別用VP0-F/R和VP1-F/R引物擴(kuò)增VP0和VP1基因，結(jié)果顯示，分別在934 bp和668 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker； 1.引物VP1-F/R擴(kuò)增產(chǎn)物； 2.引物VP0-F/R擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 VP1和VP0基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 SUMO-VP0和SUMO-VP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分別對PCR擴(kuò)增后的VP0、VP1基因和pE-SUMO空載體質(zhì)粒用BsaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切，酶切后用T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌JM109中。pE-SUMO載體經(jīng)過雙酶切后，酶切位點(diǎn)BsaⅠ對應(yīng)的核苷酸序列發(fā)生變化，所以不能用BsaⅠ和XhoⅠ對重組的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。通過菌液PCR方法對挑選的單克隆進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果顯示，分別在934 bp和668 bp處出現(xiàn)陽性條帶(圖2)。對鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果與合成的序列相一致，表明成功構(gòu)建SUMO-VP0和SUMO-VP1重組質(zhì)粒。

2.3 SUMO-VP0和SUMO-VP1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

從圖3可以看出，在約53 ku和43 ku處各有1條特異性的條帶，與預(yù)測的SUMO-VP0和SUMO-VP1重組蛋白的大小相一致，且目的蛋白大部分以可溶性的形式存在。Western blot結(jié)果顯示，SUMO-VP0和SUMO-VP1重組蛋白可以與抗組氨酸標(biāo)簽單抗發(fā)生特異性結(jié)合(圖3)。

2.4 SUMO-VP0和SUMO-VP1重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

分別對重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)時間、誘導(dǎo)劑IPTG濃度和誘導(dǎo)表達(dá)溫度等進(jìn)行優(yōu)化。從圖4可以看出，不同表達(dá)時間對SUMO-VP0的表達(dá)量影響比較大，在誘導(dǎo)12 h后表達(dá)量達(dá)到最高；而對SUMO-VP1影響較小，在8 h和12 h時表達(dá)量無明顯差別，故選用誘導(dǎo)時間為8 h。

M.DL2000 DNA Marker； 1—4均為SUMO-VP0菌液； 5—8均為SUMO-VP1菌液圖2 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定結(jié)果

M.蛋白質(zhì)Marker； 1、2和5、6分別為SUMO-VP0超聲后的沉淀和上清；3、4和7、8分別為SUMO-VP1超聲后的沉淀和上清圖3 重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1的SDS-PAGE分析和Western blot檢測結(jié)果

M.蛋白質(zhì)Marker； 1—5和6—10分別是4、6、8、10、12 h誘導(dǎo)表達(dá)的SUMO-VP0和SUMO-VP1圖4 重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1經(jīng)不同時間的誘導(dǎo)表達(dá)情況

由圖5可以看出，不同濃度IPTG對重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1的表達(dá)并沒有明顯影響，在0.1 mmol/LIPTG誘導(dǎo)條件下，2種重組蛋白的表達(dá)量已經(jīng)達(dá)到最高。由圖6可知，重組蛋白SUMO-VP0在25 ℃條件下，可溶性表達(dá)量達(dá)到最高；在37 ℃條件下，重組蛋白的可溶性表達(dá)量和總體表達(dá)量均達(dá)到最低。因此，重組蛋白SUMO-VP0的最佳誘導(dǎo)溫度為25 ℃。重組蛋白SUMO-VP1在不同溫度條件下表達(dá)情況與SUMO-VP0相反，隨著溫度的升高，重組蛋白SUMO-VP1的表達(dá)量不斷增加，在37 ℃條件下，可溶性蛋白表達(dá)量達(dá)到最高，說明37 ℃適合重組蛋白SUMO-VP1的可溶性表達(dá)。因此，SUMO-VP0可溶性蛋白的最佳表達(dá)條件為：20 ℃條件下，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12 h；SUMO-VP1可溶性蛋白的最佳表達(dá)條件為：37 ℃條件下，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)8 h。

M.蛋白質(zhì)Marker； 1—6和7—12分別為經(jīng)0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的SUMO-VP0和SUMO-VP1圖5 重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1在不同IPTG濃度下的誘導(dǎo)表達(dá)情況

M.蛋白質(zhì)Marker； 1、3、5、7和2、4、6、8分別為SUMO-VP0在16、20、25、37 ℃條件下表達(dá)超聲后的沉淀和上清；9、11、13、15和10、12、14、16 分別為SUMO-VP1在16、20、25、37 ℃條件下表達(dá)超聲后的沉淀和上清圖6 重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1在不同溫度條件下可溶性蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果

2.5 2種重組蛋白的反應(yīng)原性檢測結(jié)果

用抗O型FMDV的陽性血清通過Western blot檢測重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1的反應(yīng)原性，結(jié)果(圖7)表明，分別在53 ku和43 ku位置處的特異性條帶能夠被抗O型FMDV的陽性血清所識別，與抗組氨酸標(biāo)簽單抗檢測結(jié)果相一致，說明獲得的重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1均具有很好的反應(yīng)原性。

M.蛋白質(zhì)Marker； 1和2分別為SUMO-VP0的超聲沉淀和上清； 3和4分別為SUMO-VP1的超聲沉淀和上清圖7 重組蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1的反應(yīng)原性分析

3 結(jié)論與討論

SUMO是一種小分子泛素類修飾蛋白，在細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)的核質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用[7-8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，SUMO可以作為分子伴侶與重組蛋白融合表達(dá)，這種融合表達(dá)不僅可以抵抗蛋白酶水解重組蛋白，還可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量，增加蛋白質(zhì)的可溶性和穩(wěn)定性[5-6]。SUMO標(biāo)簽可以通過SUMO蛋白酶酶切，切割之后不會留有殘余氨基酸。姜媛媛等[9]將SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)與pET-32a表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行對比，結(jié)果表明，通過SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)可以獲得純度較高的可溶性成熟蛋白，而目的蛋白在pET-32a表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量極低，幾乎檢測不到。曲栗等[10]利用SUMO表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)雞傳染性法氏囊病毒的VP3基因，并且用SUMO蛋白酶酶切，得到的VP3蛋白通過Western blot鑒定具有很好的抗原性?？傊?，SUMO表達(dá)系統(tǒng)可以作為一種高效的原核表達(dá)系統(tǒng)以獲得可溶性好、純度高的目的蛋白。

本研究利用pE-SUMO作為表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有6×組氨酸標(biāo)簽和SUMO標(biāo)簽，這2種標(biāo)簽都可以增加目的蛋白的可溶性表達(dá)。另外，6×組氨酸蛋白可與鎳柱結(jié)合，因此，可以利用親和層析技術(shù)對融合表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化。據(jù)報(bào)道，組氨酸融合標(biāo)簽由6個帶有較強(qiáng)正電荷的堿性氨基酸組成，在SDS-PAGE電泳中移動速度降低，會造成分子質(zhì)量比實(shí)際偏大[11]。本試驗(yàn)通過SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)，2個重組蛋白的分子質(zhì)量確實(shí)比理論值偏大，這符合預(yù)期的結(jié)果。pE-SUMO載體上含有BsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)在SUMO標(biāo)簽蛋白與目的蛋白之間，可以利用SUMO蛋白酶實(shí)現(xiàn)N端無殘留切割，從而得到純凈的目的蛋白。Western blot檢測結(jié)果說明，表達(dá)得到的重組蛋白能夠被抗O型FMDV的陽性血清識別，說明表達(dá)的重組蛋白具有很好的反應(yīng)原性，可以用于后期的免疫試驗(yàn)。

目前，預(yù)防口蹄疫的主要措施是注射滅活疫苗，但滅活疫苗存在滅活不完全引起疫病暴發(fā)的危險，基因工程疫苗成為研究的熱點(diǎn)。由于VP1蛋白主要暴露在FMDV病毒顆粒的表面，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，因此，F(xiàn)MDV基因工程疫苗主要是以VP1蛋白為研究熱點(diǎn)[12-13]。據(jù)報(bào)道稱，VP1結(jié)構(gòu)蛋白不能單獨(dú)形成病毒樣顆粒，需要將FMDV的VP0、VP1和VP3三種蛋白質(zhì)共表達(dá)，在合適的條件下裝配才能夠形成病毒樣顆粒[14]。Guo等[15]用SUMO表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了可溶性的VP0、VP1和VP3重組蛋白，并用SUMO蛋白酶將SUMO標(biāo)簽切除，在合適的條件下發(fā)現(xiàn)，VP0、VP1和VP3三種蛋白質(zhì)能夠自我組裝形成病毒樣顆粒，這種病毒樣顆粒在形狀和結(jié)構(gòu)上與FMDV病毒顆粒一致。將這種病毒樣顆粒與佐劑結(jié)合后免疫豬，通過病毒中和試驗(yàn)?zāi)軌驒z測到中和性抗體，通過T細(xì)胞增殖試驗(yàn)和對γ干擾素的檢測發(fā)現(xiàn)，病毒樣顆粒能夠使機(jī)體產(chǎn)生很好的免疫效果。本研究利用SUMO表達(dá)載體高效表達(dá)FMDV的VP0和VP1結(jié)構(gòu)蛋白，并通過對多種表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得了這2種結(jié)構(gòu)蛋白最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件，并且用抗FMDV的陽性血清檢測發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的重組蛋白有很好的反應(yīng)原性。本研究為FMDV病毒樣顆粒的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為FMDV基因工程亞單位疫苗的研究提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

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Soluble Expression and Immuneoreactivity Analysis of FMDV VP0 and VP1 Protein

ZHAO Baolei1,LIU Yunchao2,CHEN Yumei2,JI Pengchao2,WANG Jucai1,LIU Chang2,YANG Suzhen2,ZHANG Gaiping1,2*

(1.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Henan Agricultural Universitey,Zhengzhou 450002,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology of Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

To obtain efficient soluble expressive VP0 and VP1 protein of O-type foot-and-mouth disease virus (FMDV).We optimizedVP0 andVP1 gene according to the preference codon usage ofE.Coli.The FMDV structural proteinVP0 andVP1 genes were synthesized and cloned into pE-SUMO vector.These two recombinant plasmids,SUMO-VP0 and SUMO-VP1 were transformed intoE.coliBL21(DE3) competent cells.Through optimizing the inducing temperature,time and the concentration of IPTG,we got that the optimized expression conditions of SUMO-VP1 was induced by 0.1 mmol/L IPTG,and induced at 20 ℃ for 8 h .The best inducing conditions of SUMO-VP0 was induced by 0.1 mmol/L IPTG,and expressed 12 h at 37 ℃.SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the soluble protein could be identified by standard positive serum of FMDV,which confirmed that the fusion protein had good responsiveness.

FMDV; structural protein VP0 and VP1; soluble protein expression; SUMO tag

2016-09-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0500704)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(152300410238)；河南省科技創(chuàng)新基礎(chǔ)前瞻類項(xiàng)目(20141644)；河南省重大科技專項(xiàng)(141100110100)

趙寶磊(1990-)，男，河南許昌人，在讀碩士研究生，研究方向：動物疫病與疫苗。E-mail:baoleizhao2010@163.com

*通訊作者：張改平(1960-)，男，河南內(nèi)黃人，研究員，博士，主要從事動物疫病免疫機(jī)制與疫苗研究。 E-mail:zhanggaiping2003@163.com

S855.3

A

1004-3268(2017)02-0105-06