球孢白僵菌胞外酶的活性與其毒力的相關(guān)性

張丹丹， 劉廷輝， 趙 丹， 李瑞軍， 董建臻， 陸秀君

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001)

球孢白僵菌胞外酶的活性與其毒力的相關(guān)性

張丹丹， 劉廷輝， 趙 丹， 李瑞軍， 董建臻， 陸秀君

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001)

為了研究球孢白僵菌胞外酶的活性與其毒力的相關(guān)性，以黃粉蟲為標(biāo)準(zhǔn)試蟲測(cè)定9株球孢白僵菌的毒力，并分別測(cè)定其胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酶的生產(chǎn)水平。相關(guān)分析表明，3種胞外酶活性與毒力的線性關(guān)系分別為y1=-13.815 4x+185.954 4，r12=0.495 7；y2=-10.976 0x+58.977 0，r22=0.432 5；y3=-1.122 3x+8.469 5，r32=0.830 3。由r2值可以看出，胞外脂肪酶活性與毒力的線性關(guān)系最明顯，脂肪酶活性可作為大量菌株毒力初篩的參考性指標(biāo)。

球孢白僵菌；胞外酶；毒力；相關(guān)性

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是目前國(guó)內(nèi)外研究應(yīng)用最為廣泛的害蟲生防真菌，同時(shí)也是一類廣譜性的昆蟲病原真菌[1]，白僵菌以其高效、低毒、不污染環(huán)境、對(duì)人畜無(wú)害等特點(diǎn)長(zhǎng)期以來(lái)受到了廣泛的關(guān)注和深入的研究[2]。白僵菌對(duì)多種害蟲具有致病性，能侵染包括15目149科521屬700多種昆蟲和至少6科7屬13種蜱螨類[3-4]，并且致病力強(qiáng)、持效期長(zhǎng)、不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)人畜無(wú)害，利用其開發(fā)微生物殺蟲劑具有良好的發(fā)展前景[5-6]。

大量研究表明，白僵菌主要通過(guò)與寄主的表皮接觸，從昆蟲的體壁、氣門、節(jié)間膜、氣孔及傷口等處侵入而感染，但有時(shí)也在昆蟲取食、呼吸時(shí)經(jīng)過(guò)消化道和呼吸道等內(nèi)部途徑進(jìn)行感染[7]。昆蟲的表皮成分可以為白僵菌的萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)對(duì)芽管的形成具有刺激作用。白僵菌分生孢子吸收營(yíng)養(yǎng)后開始萌發(fā)，從端部或側(cè)面長(zhǎng)出芽管[8]。另有研究表明，球孢白僵菌在代謝過(guò)程中能合成、分泌一系列胞外酶，如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酶等，它們?cè)诎捉┚肭旨闹鲿r(shí)，尤其在穿透昆蟲體壁過(guò)程中，起到溶解昆蟲表皮以利于菌體侵染的作用[1]。有學(xué)者研究表明，球孢白僵菌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酶產(chǎn)生水平與其菌株毒力之間存在一定的相關(guān)性[9-14]。目前測(cè)定球孢白僵菌毒力一般采用生物測(cè)定的方法，這種方法受到許多因素的影響，包括試蟲的蟲齡、生理狀態(tài)、生物測(cè)定時(shí)的環(huán)境條件等，常使毒力測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性較差，如果可以通過(guò)借助普通的生物化學(xué)方法測(cè)定這些酶的活性，間接揭示菌株的毒力，在大量菌株中篩選高毒力菌株的同時(shí)就可以實(shí)現(xiàn)既準(zhǔn)確又高效的目的[15]。因此，本試驗(yàn)測(cè)定了9株球抱白僵菌的胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酶的活性及其對(duì)黃粉蟲(TenebriomolitorL.)的毒力，并進(jìn)行相關(guān)性研究，以期探討上述3種體壁降解酶作為毒力指標(biāo)的可靠性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 9株球孢白僵菌菌株，由筆者實(shí)驗(yàn)室從北方野外土壤中誘集分離得到。

1.1.2 試蟲 黃粉蟲，筆者實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)所得的低齡幼蟲。

1.1.3 藥品 吐溫-80、PDA培養(yǎng)基、SDA培養(yǎng)基、酪氨酸、酪蛋白、Folin-酚試劑、幾丁質(zhì)、二硝基水楊酸、橄欖油、NaOH、酚酞、聚乙烯醇、磷酸緩沖液(pH值為7.5)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株毒力測(cè)定

1.2.1.1 孢子懸浮液的制備 將實(shí)驗(yàn)室保存的球孢白僵菌菌株，在PDA平板上(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)10 d，在無(wú)菌條件下刮取孢子粉，放于裝有少量含0.05% 吐溫-80無(wú)菌水的組織研磨器中研磨，充分研磨后倒入滅菌后的小燒杯中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并將孢子懸浮液濃度調(diào)至1億個(gè)/mL備用。

1.2.1.2 毒力測(cè)定 將3齡黃粉蟲幼蟲浸入上述配好的孢子懸浮液中3 s后，放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，并用無(wú)菌水保濕，用0.05% 吐溫-80無(wú)菌水處理作對(duì)照。每天觀察并記錄死蟲數(shù)，死蟲進(jìn)行保濕培養(yǎng)，觀察并記錄蟲體是否有菌絲長(zhǎng)出。

1.2.2 胞外酶測(cè)定

1.2.2.1 菌株液體培養(yǎng)，粗酶液制備 根據(jù)“1.2.1.1”節(jié)中的方法制備孢子懸浮液，以1%的量接種到100 mL SDA培養(yǎng)基中(置于250 mL三角瓶中)，于(25±1) ℃恒溫?fù)u床中 150 r/min 振蕩培養(yǎng)，按試驗(yàn)進(jìn)度定時(shí)取出培養(yǎng)物，過(guò)濾后留濾液測(cè)定胞外酶活性。

1.2.2.2 蛋白酶活性的測(cè)定 (1)取培養(yǎng)5 d后的液體培養(yǎng)物，用滅菌濾紙過(guò)濾，留濾液(酶液)備用。(2)用Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH值為8.5)將底物酪蛋白配成 10 mg/mL 酪蛋白溶液，取1 mL 10 mg/mL酪蛋白溶液，加入1 mL待測(cè)酶液中，于37 ℃反應(yīng)30 min，每個(gè)處理3次重復(fù)。(3)用2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸中止反應(yīng)并過(guò)濾。(4)留濾液用Folin-酚試劑進(jìn)行檢測(cè)，每管加入400 μL濾液，2 mL Folin等A、B混合液(1 ∶50的比例配制)室溫下靜止反應(yīng) 10 min，加入200 μL酚試劑，靜止30 min，在650 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以1 min催化分解生成1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)活性單位(U/mL)，用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得出不同菌株的胞外蛋白酶的活性。

1.2.2.3 幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定 (1)取培養(yǎng)4 d后的液體培養(yǎng)物，用滅菌濾紙過(guò)濾，留濾液(酶液)備用。(2)以1.0 mL 的1%膠體幾丁質(zhì)為底物，加入0.5 mL酶液，50 ℃水浴反應(yīng)1 h。(3)用DNS (3，5-二硝基水楊酸)法測(cè)定產(chǎn)生的還原糖。樣品液適當(dāng)稀釋，使糖濃度為0.1～1.0 mg/mL，取 1.0 mL 稀釋后的糖液于15 mL刻度試管中，加入2.0 mL DNS試劑，沸水浴反應(yīng)2 min，冷卻后用水補(bǔ)足到15 mL刻度，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。從葡萄糖制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出不同菌株幾丁質(zhì)酶的活性。

1.2.2.4 脂肪酶活性的測(cè)定 (1)取培養(yǎng)4 d后的液體培養(yǎng)物，用滅菌濾紙過(guò)濾，留濾液(酶液)備用。(2)在100 mL三角瓶中加入4 mL聚乙烯醇橄欖油乳化劑和5 mL 0.025 mol/L 磷酸緩沖液(pH值為7.5)，置于40 ℃預(yù)熱5～10 min，加入 1 mL 酶液，計(jì)時(shí)準(zhǔn)確反應(yīng)16 min后立即加入15 mL 95%乙醇終止酶反應(yīng)。(3)加酚酞指示劑2～3滴，用0.1 mol/L NaOH滴定至紅色為終點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 9株球孢白僵菌菌株對(duì)黃粉蟲的毒力測(cè)定結(jié)果

球孢白僵菌對(duì)黃粉蟲的毒力測(cè)定結(jié)果如表1所示，經(jīng)過(guò)方差和顯著性水平分析可知，其中B07-09-7毒力最高，致死中時(shí)為2.29 d；B07-09-124毒力最低，致死中時(shí)為 4.39 d。

表1 9株球孢白僵菌菌株對(duì)黃粉蟲的致死中時(shí)(LT50)

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫、小寫字母分別表示在1%、5%水平上差異顯著。下表同。

2.2 蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果

球孢白僵菌蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果如表2所示，經(jīng)過(guò)方差和顯著性水平分析可知，9株球孢白僵菌的蛋白酶活性有明顯的差異。其中，B07-09-7的蛋白酶活性最高，高達(dá)174.51 U/mL，而B07-09-124的蛋白酶活性只有 125.22 U/mL。對(duì)表1、表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，得出球孢白僵菌蛋白酶活性y1和致死中時(shí)x之間的線性關(guān)系為y1=-13.815 4x+185.954 4、r1=0.704 0、r12=0.495 7 (P=0.034 3)。由此可以看出，球孢白僵菌蛋白酶活性與致死中時(shí)的線性關(guān)系并不明顯，蛋白酶活性單獨(dú)作為衡量菌株毒力水平的指標(biāo)預(yù)測(cè)性較差。

表2 9株球孢白僵菌菌株蛋白酶活性方差分析結(jié)果

2.3 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定結(jié)果

球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定結(jié)果如表3所示，經(jīng)過(guò)方差和顯著性水平分析可知，9株球孢白僵菌的幾丁質(zhì)酶活性有明顯的差異。其中，B07-09-7的幾丁質(zhì)酶活性最高，高達(dá)38.61 U/mL，而B07-09-143的幾丁質(zhì)酶活性只有 8.10 U/mL，結(jié)合表1得出球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶活性y2和致死中時(shí)x之間線性關(guān)系為y2=-10.976 0x+58.977 0、r2=0.657 7、r22=0.432 5(P=0.054 2)。由此可以看出，球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶活性與致死中時(shí)的線性關(guān)系并不明顯。

2.4 脂肪酶活性測(cè)定結(jié)果

球孢白僵菌脂肪酶活性的測(cè)定結(jié)果如表4所示，經(jīng)過(guò)方差和顯著性水平分析可知，9株球孢白僵菌的脂肪酶活性有明顯的差異。其中，B07-06-362的脂肪酶活性最高，高達(dá)6.04 U/mL，而B07-09-143的脂肪酶酶活性只有 3.34 U/mL，結(jié)合表1得出球孢白僵菌脂肪酶活性y3和致死中時(shí)x之間線性關(guān)系y3=-1.122 3x+8.469 5、r3=0.911 2、r32=0.830 3(P=0.000 6)。由此可以看出，球孢白僵菌脂肪酶活性與毒力極顯著相關(guān)。

表3 9株球孢白僵菌菌株幾丁質(zhì)酶活性方差分析結(jié)果

表4 9株球孢白僵菌菌株脂肪酶活性方差分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

9株球孢白僵菌的胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶活性與對(duì)黃粉蟲毒力的相關(guān)性研究結(jié)果中，脂肪酶活性與毒力的相關(guān)性最顯著，就相關(guān)性而言，脂肪酶活性的高低在一定程度上可以表達(dá)白僵菌毒力的強(qiáng)弱。r2=0.830 3，即脂肪酶可以表達(dá)毒力的83.03%，由此可以考慮用脂肪酶活性表示球孢白僵菌毒力。

球孢白僵菌的脂肪酶活性對(duì)白僵菌侵染寄主的過(guò)程有一定的影響。球孢白僵菌入侵寄主分幾個(gè)階段，其中包括孢子的萌發(fā)、附著、入侵和定殖，而入侵是其中至關(guān)重要的一步。根據(jù)昆蟲表皮的結(jié)構(gòu)，白僵菌入侵寄主的第1道屏障是昆蟲蟲體表面的蠟脂，而脂肪酶可以消除蠟脂層，打破白僵菌入侵寄主的第1道屏障，為其進(jìn)一步入侵提供基礎(chǔ)。Pavlyushin發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌的脂肪酶活性與其對(duì)昆蟲的毒力有關(guān)[16]，Smith等的試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)[17]。脂肪酶的作用不僅消除了孢子入侵的屏障，而且可能給真菌提供營(yíng)養(yǎng)。由此可認(rèn)為，脂肪酶對(duì)降解昆蟲表皮、提供真菌營(yíng)養(yǎng)具有一定的貢獻(xiàn)。

脂肪酶僅是昆蟲體壁結(jié)構(gòu)物降解酶系之一。本研究結(jié)果表明脂肪酶在白僵菌侵染過(guò)程中的重要作用，這一結(jié)論與馮明光所得出的胞外蛋白酶作為毒力生物測(cè)定的補(bǔ)充指標(biāo)[15]有一定的出入。因此，無(wú)論是用胞外蛋白酶活性還是用胞外脂肪酶活性作為白僵菌毒力指標(biāo)，都須持謹(jǐn)慎態(tài)度，應(yīng)當(dāng)有條件地使用或者用于大量菌株的初篩工作中。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.025

2015-11-24

國(guó)家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(編號(hào)：CARS-14)。

張丹丹(1990—)，女，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向?yàn)楹οx生物防治及分子生物學(xué)。E-mail：1404547846@qq.com。

李瑞軍，博士，副教授，研究方向?yàn)楹οx生物防治及農(nóng)業(yè)生態(tài)安全。E-mail：liruijun99@sina.com。

S432.4+4

A

1002-1302(2017)02-0093-03

張丹丹，劉廷輝，趙 丹，等. 球孢白僵菌胞外酶的活性與其毒力的相關(guān)性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：93-95.