張 智，劉 慧，劉 奇，鄭喜群*，曲 巍，楊可心

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾大學(xué) 黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米肽-鋅螯合物結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性分析

張 智1，劉 慧1，劉 奇1，鄭喜群2,*，曲 巍1，楊可心1

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾大學(xué) 黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

以玉米肽（corn peptide，CP）為參照研究玉米肽-鋅（CP-Zn）螯合物的結(jié)構(gòu)表征和體內(nèi)抗氧化活性變化。采用氨基酸分析、紫外掃描、紅外光譜研究結(jié)構(gòu)變化；對小鼠灌胃不同劑量的CP、CP-Zn（低、中、高劑量組分別為50、150、250 mg/（kg·d）），測其血清、肝臟中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力，分析比較CP、CP-Zn體內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果表明：螯合前后氨基酸組成、紫外吸收光譜、紅外吸收光譜存在明顯變化，Zn2＋與—COOH、—NH2、C＝O進(jìn)行了配位；CP高劑量、CP-Zn高、中劑量能顯著降低小鼠血清、肝臟中MDA含量（P＜0.05或P＜0.01），提高SOD活力（P＜0.01）、GSH-Px活力（P＜0.05或P＜0.01），CP-Zn抗氧化活性優(yōu)于CP。由此可見，CP-Zn屬于螯合物，同時具有增強(qiáng)CP抗氧化活性的作用。

玉米肽-鋅螯合物；結(jié)構(gòu)；抗氧化

蛋白生物活性肽具有多種生理功能[1]，不同原料來源的蛋白活性肽由于不同的氨基酸組成和連接方式，其生理活性也多種多樣[2]。其中Huang Wenhao等[3]研究表明玉米肽對高血壓大鼠具有降壓的作用，宋亮等[4]通過酶解玉米蛋白粉制備的ACE抑制肽，抑制率達(dá)到85.65%；在解酒功能方面Yamaguchi[5]、Yu Guocai[6]等先后做了深入研究，結(jié)果表明玉米肽中疏水性氨基酸在解酒方面具有重要作用；Li Jiangtao等[7]研究了玉米肽抗腫瘤機(jī)制，結(jié)果表明玉米肽能有效的抑制癌細(xì)胞，還可以增強(qiáng)小鼠的免疫系統(tǒng)，因此玉米肽被認(rèn)為是一種安全有效的具有抗癌功能的活性肽；同時玉米肽具有抗氧化[8]、降血脂[9]、抗疲勞[10]、增強(qiáng)記憶力[11]、增強(qiáng)運動能力[12]等功能。在抗氧化方面，王子懷等[13]對肽-金屬螯合物進(jìn)行的綜述表明，與具有抗氧化活性的金屬離子螯合可提高原肽的活性，甚至優(yōu)于目前廣泛使用的抗氧化劑。Prasad等[14]以及俞園園[15]闡述了鋅在抗氧化活性方面有著重要的作用，同時方細(xì)絹[16]、林謝鳳[17]等已陸續(xù)報道肽-鋅螯合可以提高抗氧化活性。螯合是一門高新技術(shù)，肽-鋅螯合是Zn2＋嵌合在兩個肽分子中間的一種新結(jié)構(gòu)形式，肽分子像“蟹鉗”一樣鉗著Zn2＋，形成穩(wěn)定的螯合結(jié)構(gòu)，由于肽可通過腸黏膜細(xì)胞直接進(jìn)入血液[18]，使Zn2＋和小肽一起進(jìn)入機(jī)體進(jìn)而促進(jìn)人體吸收[19]，進(jìn)而能有效提高其生物利用率[20]。肽-鋅具有化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、適口性好、副作用少、具有一定的生物學(xué)效價以及生物活性功能等優(yōu)勢，具有廣闊的市場前景。

本實驗采用Zn2＋修飾玉米肽（corn peptide，CP）生成玉米肽-鋅（CP-Zn）螯合物，以期提高玉米肽抗氧化活性，同時到達(dá)補充微量元素鋅的作用。通過氨基酸分析、紫外掃面、傅里葉變換紅外光譜對CP-Zn螯合位點初步鑒定，觀察CP、CP-Zn螯合物對小鼠血清、肝臟中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性的影響，分析比較CP、CP-Zn螯合物的抗氧化活性，為拓展玉米肽的應(yīng)用范圍和領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米肽由齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供。

MDA試劑盒、SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所；溴化鉀（光譜純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗動物

SPF級小鼠（合格證號：SCXK黑2013-004）6～8 周齡，18～22 g，由黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物評價中心提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備

722s可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 CP-Zn螯合物制備

玉米肽通過Sephadex G-25分級得到肽段（平均分子質(zhì)量為572 D，肽含量為75.83%），肽段與硫酸鋅按質(zhì)量比8∶1，在pH 6.2條件下，60 ℃水浴40 min，而后4 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)流水透析24 h，置于烘箱60 ℃烘干，得到淡黃色針狀粉末，為CP-Zn螯合物，備用。

1.2.2 CP-Zn螯合物組成成分及螯合率的測定

水分含量的測定：采用直接干燥法，參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；蛋白含量測定：采用微量凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

含鋅量測定：采用乙二胺四乙酸滴定法。將CP-Zn螯合物配制成0.2 g/mL溶液，取10 mL于錐形瓶中，加入10 mL NH3-NH4Cl緩沖溶液，滴入鉻黑T指示劑，用0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉滴定，溶液由紫色變?yōu)榈{(lán)色停止滴定，記錄消耗乙二胺四乙酸二鈉的體積，按式（1）計算含鋅量，按式（2）計算鋅的螯合率。

式中：X為CP-Zn螯合物含鋅量/%；M為鋅的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；C為乙二胺四乙酸二鈉的濃度/（mol/L）；V為滴定乙二胺四乙酸二鈉的體積/mL；m為稱取CP-Zn螯合物的質(zhì)量/g。

式中：Y為鋅的螯合率/%；m為CP-Zn螯合物的質(zhì)量/g；m’為鋅的投入量/g。

1.2.3 CP-Zn螯合物結(jié)構(gòu)表征分析

1.2.3.1 氨基酸組成分析

準(zhǔn)確稱取CP、CP-Zn螯合物10 mg，放入消化管中，加入12 mL 6 mol/L的HCl并充入氮氣，置于120 ℃烘箱中水解10 h，用氨基酸自動分析儀測定其中氨基酸組成及含量。

1.2.3.2 紫外掃描分析

將CP以及CP-Zn螯合物配制成1.6 mg/mL的水溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

1.2.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

分別取CP及CP-Zn螯合物樣品2 mg和干燥的光譜純KBr 200 mg放入瑪瑙研缽中，混合研磨均勻。將研磨完畢的粉末裝入壓片模具，抽氣加壓，使壓力在60 MPa左右維持5 min。卸掉壓力得到透明的薄片，放入紅外光譜儀進(jìn)行掃描分析，在400～4 000 cm－1范圍內(nèi)測定其紅外吸收光譜。

1.2.4 抗氧化活性實驗分組

將小鼠隨機(jī)分組，各組小鼠同室分籠飼養(yǎng)，灌胃給藥，30 d喂養(yǎng)，給藥劑量根據(jù)《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》擬定[21]，具體實驗安排如表1所示。

表1 抗氧化活性實驗分組Table1 Grouping of mice for evaluation of in vviivvoo antioxidant activ ity

1.2.5 體內(nèi)抗氧化指標(biāo)測定

停藥后隔日處死小鼠，眼眥取血，3 500 r/min離心15 min，取上層血清液。解剖小鼠，取肝臟用生理鹽水清理干凈后用吸水紙吸取水分，稱取肝組織制備10%的肝組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液。血清以及組織勻漿上清液均參照試劑盒說明書測定MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定肝組織中蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，Origin 8.5軟件作圖，采用SPSS 19.0軟件中Duncan氏多重比較檢驗進(jìn)行，各組數(shù)據(jù)用±s表示，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)意義上的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CP-Zn螯合物組成成分含量及螯合率分析

表2 CP-Zn螯合物的組成成分含量及螯合率分析Table2 Chemical composition and chelating rate of CP-Zn complex %

對CP-Zn螯合物的主要成分及螯合率分析結(jié)果如表2所示，可知組分中蛋白質(zhì)及鋅的含量相對較高，所占比例為83.17%；CP-Zn螯合率為76.68%，其他成分中包含灰分、脂肪、鈉鹽等，其中鈉鹽可能是由在螯合反應(yīng)中調(diào)節(jié)pH值時加入NaOH或HCl所致，在后續(xù)透析純化過程中未完全除盡。

2.2 CP-Zn螯合物結(jié)構(gòu)表征分析

2.2.1 氨基酸組成分析

Zn2＋與CP進(jìn)行螯合時，對CP整體構(gòu)象產(chǎn)生影響，由于氨基酸的極性和側(cè)鏈基團(tuán)的差異，對金屬離子的親和能力會有所不同，所以Zn2＋會與對其具有較強(qiáng)親和能力的氨基酸的氨基N原子和羧基O原子形成配位鍵。單位空間里，當(dāng)Zn2＋與氨基酸配位時，原有氨基酸的總量會發(fā)生變化，因此螯合前后氨基酸組分含量會有所不同。CP、CP-Zn螯合物進(jìn)行氨基酸組成分析如表3所示，CP中抗氧化活性較強(qiáng)的氨基酸[22]占總氨基酸的7.9%，與Zn2＋螯合后為9.8%，此方面與后面抗氧化活性效果相呼應(yīng)；螯合前后，必需氨基酸占總氨基酸含量分別為34.06%、31.41%，變化趨勢與汪婧瑜等[23]結(jié)果相似，螯合后氨基酸總量減少了5.49%，減少的部分可能由Zn2＋代替，與霍健聰[24]結(jié)果相似，初步判斷CP與Zn2＋發(fā)生了反應(yīng)。

表3 CP和CP-Zn螯合物的氨基酸組成Table3 Amino acid composition of CP and CP-Zn complex %

2.2.2 紫外掃描分析

圖1 紫外吸收光譜圖Fig.1 UV spectra of CP and CP-Zn complexmplex

由圖1可知，CP與CP-Zn螯合物同濃度的紫外吸收光譜圖顯示二者的吸收波長及強(qiáng)弱有所不同：CP在228 nm波長處的吸收峰藍(lán)移至230 nm（CP-Zn），可能是Zn2＋與羰基（C＝O）產(chǎn)生了絡(luò)合作用，影響了羰基（C＝O）n→δ*的電子躍遷所導(dǎo)致；在270 nm波長處的吸收峰紅移至268 nm，這可能是Zn2＋與配體（N—C—O）絡(luò)合后，影響了配體（N—C—O）δ→δ*的電子躍遷所導(dǎo)致。CP-Zn螯合物在250 nm波長處附近的吸收峰明顯增強(qiáng)，而硫酸鋅溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)沒有吸收峰，進(jìn)一步確認(rèn)有螯合物的生成。

2.2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

如圖2所示，CP、CP-Zn螯合物在400～4 000 cm－1紅外光譜圖可以看出，CP與Zn2＋形成螯合物后，吸收峰位置以及強(qiáng)度發(fā)生了變化。CP在3 400 cm－1附近有較寬的吸收峰，同時在927.59 cm－1處有吸收峰，說明CP含—COOH結(jié)構(gòu)，CP-Zn螯合物中3 400 cm－1附近吸收峰變窄，同時在927.59 cm－1處及附近無吸收峰，說明CP-Zn螯合物無裸露—COOH結(jié)構(gòu)，—COOH已與Zn2＋結(jié)合，這與周亮[25]結(jié)果相似；CP-Zn螯合物在3 068.67 cm－1處NH4＋吸收峰消失，而1 045.23 cm－1處出現(xiàn)了PtNH2吸收峰，說明—NH2已與Zn2＋結(jié)合；在指紋區(qū)1 655.59 cm－1處C＝O吸收峰紅移至1 631.48 cm－1，說明C＝O也與Zn2＋形成了配位反應(yīng)，綜上分析，CP-Zn螯合物的分子結(jié)構(gòu)中，Zn2＋分別在CP分子的—COOH、—NH2和C＝O位置配位結(jié)合。

圖2 傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of CP and CP-Zn complexmplex

2.3 CP-Zn螯合物體內(nèi)抗氧化指標(biāo)分析

圖3 小鼠血清和肝臟中MDA的含量Fig.3 MDA contents in serum and liver of mice

MDA含量是評價自由基在體內(nèi)代謝的重要指標(biāo)，其含量的多少直接反映了機(jī)體受自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷程度[26]。由圖3可知，與空白對照組相比，在血清MDA含量中CP高劑量、CP-Zn高、中劑量組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中效果最較好的CP-Zn高劑量組降低了50.16%，且與其他劑量組存在極顯著性差異（P＜0.01）；在肝臟MDA含量中，除CP-Zn低劑量、CP低劑量組外其他劑量組均顯著降低（P＜0.01），其中效果較好的CP-Zn中劑量組降低了36.2%，且與其他劑量組存在極顯著差異（P＜0.01）。整體上CP、CP-Zn均可降低血清、肝臟中MDA含量，且效果CP-Zn優(yōu)于CP，說明CP可以清除機(jī)體的脂質(zhì)過氧化物的能力，CP-Zn在CP基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高此方面能力。

SOD可清除O2－·保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活性已經(jīng)作為體內(nèi)抗氧化能力的重要指標(biāo)[27]。由圖4可知，與空白對照組相比，CP高劑量、CP-Zn高、中劑量組血清SOD活力具有極顯著性差異（P＜0.01），其他劑量組無顯著性差異（P＞0.05）；在肝臟SOD活力中，除CP中、低劑量組外其他劑量組均有顯著性差異（P＜0.01）；其中效果最好的CP-Zn高劑量在血清、肝臟中SOD活力分別提高了73.31%、53.5%，且與其他劑量組存在極顯著性差異（P＜0.01）。整體分析，CP、CP-Zn螯合物均可提高機(jī)體SOD活力，效果CP-Zn螯合物優(yōu)于CP，且與劑量呈正相關(guān)，說明CP具有清除機(jī)體O2－·的能力，CP-Zn螯合物可在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高清除能力。

圖4 小鼠血清和肝臟中SOD的活力Fig.4 SOD activity in serum and liver of mice

圖5 小鼠血清和肝臟中GSH-Px的活力Fig.5 GSH-Px activity in serum and liver of mice

GSH-Px能清除代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)，而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性以及脂質(zhì)過氧化的發(fā)生有一定的阻斷作用，因此GSH-Px是判斷抗過氧化能力的重要指標(biāo)[28]。由圖5可知，與空白對照組相比，在血清GSH-Px活力中除CP中、低劑量組外其他劑量組均存在顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）；在肝臟GSH-Px活力中，CP高劑量、CP-Zn高、中劑量存在極顯著性差異（P＜0.01）；其中效果最好的CP-Zn中劑量在血清、肝臟中GSH-Px活力提高了31.26%、21.09%，且與其他劑量組存在極顯著性差異（P＜0.01）。整體分析，CP、CP-Zn螯合物均可提高機(jī)體GSH-Px活力，效果CP-Zn螯合物優(yōu)于CP，說明CP具有抗過氧化能力，CP-Zn螯合物可在CP基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高。

3 結(jié) 論

結(jié)構(gòu)表征中對照CP、CP-Zn螯合物氨基酸組成、紫外吸收光譜、紅外吸收光譜的變化，得出Zn2＋與CP分子中的—COOH、—NH2及C＝O進(jìn)行了配位反應(yīng)，形成CP-Zn螯合物。

體內(nèi)抗氧化分析結(jié)果表明，CP高劑量、CP-Zn高、中劑量可顯著降低小鼠血清、肝臟中MDA含量（P＜0.05或P＜0.01），提高SOD活力（P＜0.01）、GSH-Px活力（P＜0.05或P＜0.01），CP-Zn螯合物的抗氧化效果優(yōu)于CP。指標(biāo)改善程度與趙會艷[29]、王可[30]等研究的玉米抗氧化肽相比，本研究的CP-Zn螯合物效果更佳；與方細(xì)娟[16]研究的肽鋅中肝臟SOD指標(biāo)相似。說明CP本身具有抗氧化作用，Zn2＋改善了CP構(gòu)象，增加了抗氧化活性強(qiáng)的氨基酸含量，維持了機(jī)體抗氧化還原系統(tǒng)平衡，激活了抗氧化酶活性，從而使CP-Zn螯合物整體抗氧化活性提高。

因為CP是小分子肽，CP-Zn螯合物中Zn2＋隨CP進(jìn)入機(jī)體，易于吸收，即補充了必需氨基酸又提高了抗氧化活性，同時也是補鋅的是一種較佳形式，因此本研究的CP-Zn螯合物為食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)提供了一種新的功能制劑，具有一定的市場優(yōu)勢和前景。

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Structural Characteristics and Antioxidant Activity of Corn Peptide-Zn Complex

ZHANG Zhi1, LIU Hui1, LIU Qi1, ZHENG Xiqun2,*, QU Wei1, YANG Kexin1
(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province Normal University, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)

In this work, in comparison to corn peptide (CP), we investigated the change in structural characteristics and antioxidant activity in vivo of corn peptide-Zn (CP-Zn) complex. The structures of CP and CP-Zn were investigated through amino acid analysis, ultraviolet (UV) spectroscopy and infrared spectroscopy. CP and CP-Zn (50, 150, 250 mg/(kg·d)) at different doses were administered intragastrically to mice. Two days later, malondialdehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD) activity and glutathione peroxidase (GSH-Px) activity in serum and liver were measured to evaluate antioxidant activity in vivo of CP and CP-Zn. The results showed a signif i cant change in amino acid content, and UV and FT-IR spectra between CP and CP-Zn. Zn2+was coordinated with the -COOH, -NH2and C＝O groups of corn peptide. Compared with the control group, high-dose CP and high- and middle-dose CP-Zn could reduce MDA level (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01), and improve SOD (P ＜ 0.01) and GSH-Px activity (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01) in serum and liver. The antioxidant activity of CP-Zn was better than that of CP.

corn peptide-Zn complex; structure; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201703022

TS201.2

A

1002-6630（2017）03-0131-05

張智, 劉慧, 劉奇, 等. 玉米肽-鋅螯合物結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(3)： 131-135. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201703022. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Zhi, LIU Hui, LIU Qi, et al. Structural characteristics and antioxidant activity of corn peptide-Zn complex[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 131-135. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703022. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-29

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃重大項目（GA13B201）

張智（1964—），女，教授，博士，研究方向為生物轉(zhuǎn)化、功能食品。E-mail：ldzhangzhi@163.com

*通信作者：鄭喜群（1963—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及應(yīng)用酶學(xué)。E-mail：zhengxiqun@126.com