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      Genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯病毒檢測上的應(yīng)用綜述

      2017-03-06 00:18:46頡瑞霞張小川王效瑜郭志乾吳林科
      現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2016年21期
      關(guān)鍵詞:病毒檢測馬鈴薯

      頡瑞霞 張小川 王效瑜 郭志乾 吳林科 余幫強(qiáng) 張國輝

      摘要 生物芯片檢測技術(shù)是一種檢測速度快、靈敏度高、專一性強(qiáng)的新型病毒檢測技術(shù)。genetop馬鈴薯病毒試劑盒具有可同時檢測出7種病毒(PVY可分型PVY與PVYN)與1種類病毒,直接檢測薯塊,所用試劑無毒,操作簡便且病毒與類病毒全部檢測平均成本低于ELISA等特點。對genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及馬鈴薯種薯生產(chǎn)與質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述。

      關(guān)鍵詞 生物芯片檢測;馬鈴薯;病毒檢測

      中圖分類號 S412 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739(2016)21-0104-01

      生物芯片(Biochip)是20世紀(jì)90年代中期以來形成的最具深遠(yuǎn)意義的重大科技進(jìn)展之一[1],目前主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域[2]。近年來,生物芯片檢測技術(shù)是繼酶聯(lián)免疫吸附、免疫膠體金技術(shù)(ICG)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法應(yīng)用之后,又一種利用核酸專一性,檢測速度快、靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡便、結(jié)果易讀取的新型病毒檢測技術(shù)[3-7]。筆者就Genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及在馬鈴薯種薯生產(chǎn)中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

      1 genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測的基本原理

      genetop馬鈴薯病毒試劑盒是由臺灣巨合生物科技股份有限公司開發(fā)的新型馬鈴薯病毒生物芯片試劑,該試劑盒針對馬鈴薯病毒病中的核酸進(jìn)行分子檢測,在生物芯片孔盤表面已預(yù)先植入8種馬鈴薯病毒之專一性探針,病毒核酸萃取后經(jīng)由一步核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng),將馬鈴薯病毒特有的基因片段訊號放大,與芯片盤上的探針進(jìn)行專一性結(jié)合;反應(yīng)結(jié)果可利用肉眼直接判讀。genetop馬鈴薯病毒試劑盒主要包括核酸萃取(Virus RNA Extraction)、一步驟核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)以及核酸雜合反應(yīng)(Hybridization),同時使用生物素與堿性磷酸酶系統(tǒng)的化學(xué)非放射性的呈色方法進(jìn)行顯色,避光染色后,結(jié)果可利用肉眼直接讀取。該方法是進(jìn)行定性檢測的一種有效方法。

      2 馬鈴薯病毒病生物芯片檢測技術(shù)步驟

      2.1 樣品的制備

      取待檢測脫毒苗莖段、薯塊(取上部試管苗0.3 g或切取靠近塊莖臍部1 cm×1 cm,厚3 mm大小的表皮)樣品分別標(biāo)記后,加入細(xì)胞裂解液Rapid EB I 500 ?滋L研磨,快速離心30 min吸取上清液100 ?滋L,初樣品在PCR儀器中加熱99 ℃/85 ℃ 15 min,6 000 r/min離心30 s,吸取上清液 25 ?滋L,加入Rapid EB II 475 ?滋L即為檢測樣品,備用。

      2.2 一步驟核酸反轉(zhuǎn)錄與生物芯片雜合反應(yīng)

      向0.5 mL eppendorf管中加入檢測樣品2 ?滋L、RT-PCR混合試劑(PV-III MIX)10 ?滋L、Taq 0.3 ?滋L、RT 0.2 ?滋L,PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增程序45 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min、進(jìn)入循環(huán)后依94 ℃ 15 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s進(jìn)行30次循環(huán),72 ℃ 7 min、溫度8 ℃),PCR擴(kuò)增結(jié)束后95 ℃ 3.5 min斷鏈,進(jìn)入雜合反應(yīng)階段:吸取擴(kuò)增樣品5 ?滋L加入到生物芯片板中,加HA buffer 50 ?滋L密封,在55 ℃、1 000 r/min條件下進(jìn)行雜合反應(yīng),40 min后加200 ?滋L Wash buffer清洗液清洗兩邊,之后每孔快速加100 ?滋L混合液(Ster-Ap 酶底物∶B buffer 阻斷液=0.1∶100.0)55 ℃靜置20 min阻斷雜合反應(yīng),繼續(xù)加入200 ?滋L Wash buffer 清洗液清洗兩邊,每孔加入100 ?滋L(NBT/BCIP 呈色劑∶C buffer 呈色液=1∶100)混合液顯色,避光7 min。自來水沖洗,直接觀察結(jié)果。

      2.3 結(jié)果讀取

      生物芯片檢測的結(jié)果分為失效、陽性、陰性。失效:質(zhì)控位點(C3或A1、A5、E1、E5)不顯色,說明PCR反應(yīng)和雜合反應(yīng)已失效;陰性:質(zhì)控位點(C3和A1、A5、E1、E5)均出現(xiàn)顏色較深的黑點,檢測位點(A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5)不顯色,說明馬鈴薯樣品無被檢測病毒;陽性:質(zhì)控位點(C3和A1、A5、E1、E5)均出現(xiàn)顏色較深的黑點,檢測位點(A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5)出現(xiàn)顏色明顯的黑點,說明馬鈴薯樣品帶病毒。檢測穩(wěn)點顏色越深,樣品中的被檢測病毒含量越高。

      3 genetop馬鈴薯病毒試劑盒的優(yōu)點

      genetop馬鈴薯病毒試劑盒利用核酸的專一性,可直接

      (下轉(zhuǎn)第106頁)

      生物芯片(Biochip)是20世紀(jì)90年代中期以來形成的最具深遠(yuǎn)意義的重大科技進(jìn)展之一[1],目前主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域[2]。近年來,生物芯片檢測技術(shù)是繼酶聯(lián)免疫吸附、免疫膠體金技術(shù)(ICG)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法應(yīng)用之后,又一種利用核酸專一性,檢測速度快、靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡便、結(jié)果易讀取的新型病毒檢測技術(shù)[3-7]。筆者就Genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及在馬鈴薯種薯生產(chǎn)中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

      1 genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測的基本原理

      genetop馬鈴薯病毒試劑盒是由臺灣巨合生物科技股份有限公司開發(fā)的新型馬鈴薯病毒生物芯片試劑,該試劑盒針對馬鈴薯病毒病中的核酸進(jìn)行分子檢測,在生物芯片孔盤表面已預(yù)先植入8種馬鈴薯病毒之專一性探針,病毒核酸萃取后經(jīng)由一步核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng),將馬鈴薯病毒特有的基因片段訊號放大,與芯片盤上的探針進(jìn)行專一性結(jié)合;反應(yīng)結(jié)果可利用肉眼直接判讀。genetop馬鈴薯病毒試劑盒主要包括核酸萃?。╒irus RNA Extraction)、一步驟核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)以及核酸雜合反應(yīng)(Hybridization),同時使用生物素與堿性磷酸酶系統(tǒng)的化學(xué)非放射性的呈色方法進(jìn)行顯色,避光染色后,結(jié)果可利用肉眼直接讀取。該方法是進(jìn)行定性檢測的一種有效方法。

      2 馬鈴薯病毒病生物芯片檢測技術(shù)步驟

      2.1 樣品的制備

      取待檢測脫毒苗莖段、薯塊(取上部試管苗0.3 g或切取靠近塊莖臍部1 cm×1 cm,厚3 mm大小的表皮)樣品分別標(biāo)記后,加入細(xì)胞裂解液Rapid EB I 500 ?滋L研磨,快速離心30 min吸取上清液100 ?滋L,初樣品在PCR儀器中加熱99 ℃/85 ℃ 15 min,6 000 r/min離心30 s,吸取上清液 25 ?滋L,加入Rapid EB II 475 ?滋L即為檢測樣品,備用。

      2.2 一步驟核酸反轉(zhuǎn)錄與生物芯片雜合反應(yīng)

      向0.5 mL eppendorf管中加入檢測樣品2 ?滋L、RT-PCR混合試劑(PV-III MIX)10 ?滋L、Taq 0.3 ?滋L、RT 0.2 ?滋L,PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增程序45 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min、進(jìn)入循環(huán)后依94 ℃ 15 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s進(jìn)行30次循環(huán),72 ℃ 7 min、溫度8 ℃),PCR擴(kuò)增結(jié)束后95 ℃ 3.5 min斷鏈,進(jìn)入雜合反應(yīng)階段:吸取擴(kuò)增樣品5 ?滋L加入到生物芯片板中,加HA buffer 50 ?滋L密封,在55 ℃、1 000 r/min條件下進(jìn)行雜合反應(yīng),40 min后加200 ?滋L Wash buffer清洗液清洗兩邊,之后每孔快速加100 ?滋L混合液(Ster-Ap 酶底物∶B buffer 阻斷液=0.1∶100.0)55 ℃靜置20 min阻斷雜合反應(yīng),繼續(xù)加入200 ?滋L Wash buffer 清洗液清洗兩邊,每孔加入100 ?滋L(NBT/BCIP 呈色劑∶C buffer 呈色液=1∶100)混合液顯色,避光7 min。自來水沖洗,直接觀察結(jié)果。

      2.3 結(jié)果讀取

      生物芯片檢測的結(jié)果分為失效、陽性、陰性。失效:質(zhì)控位點(C3或A1、A5、E1、E5)不顯色,說明PCR反應(yīng)和雜合反應(yīng)已失效;陰性:質(zhì)控位點(C3和A1、A5、E1、E5)均出現(xiàn)顏色較深的黑點,檢測位點(A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5)不顯色,說明馬鈴薯樣品無被檢測病毒;陽性:質(zhì)控位點(C3和A1、A5、E1、E5)均出現(xiàn)顏色較深的黑點,檢測位點(A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5)出現(xiàn)顏色明顯的黑點,說明馬鈴薯樣品帶病毒。檢測穩(wěn)點顏色越深,樣品中的被檢測病毒含量越高。

      3 genetop馬鈴薯病毒試劑盒的優(yōu)點

      genetop馬鈴薯病毒試劑盒利用核酸的專一性,可直接檢測葉片、組培苗和種薯塊莖中是否攜帶病毒,有效解決了ELISA只檢測葉片或薯塊,不能檢測類病毒的問題,以生物芯片檢測為技術(shù)核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒比傳統(tǒng)RT-PCR檢測具有以幾個方面的優(yōu)點:時間短、準(zhǔn)確度和靈敏度高,擴(kuò)充性與多重檢測效果好,所用試劑無毒害、檢測結(jié)果肉眼可判讀,操作簡便,易于推廣。genetop馬鈴薯病毒試劑盒量化檢測時,平均價格低于ELISA,該試劑盒的推廣有助于馬鈴薯種薯病毒檢測的效率和質(zhì)量提升,操作步驟簡單,易在基層種薯監(jiān)控單位和種薯繁育企業(yè)推廣。

      4 genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯種薯質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用前景

      我國馬鈴薯種植面積54.32萬hm2,面積位居世界首位,產(chǎn)量水平較低(15 818 kg/hm2),是發(fā)達(dá)國家產(chǎn)量水平的1/3~1/2,我國馬鈴薯產(chǎn)量遠(yuǎn)低于世界平均水平(2012年FAO數(shù)據(jù))。影響我國馬鈴薯產(chǎn)量的主要因素是病毒病危害,研究證明馬鈴薯病毒引起馬鈴薯減產(chǎn)10%~30%,如果不同病害混合侵染,可以造成50%~80%以上的產(chǎn)量損失[8]。利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得脫毒復(fù)壯種薯,可從根本上解決這一問題,種薯的質(zhì)量是影響馬鈴薯產(chǎn)量的重要因素。目前,我國大面積推廣應(yīng)用的DAS-ELISA檢測技術(shù)只能檢測試管苗或植株,不能對原原種、原種和一級種薯塊莖進(jìn)行直接快速檢測[3]。特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、成本低的病毒檢測技術(shù)的缺乏是是限制馬鈴薯種薯市場瓶頸。以生物芯片檢測為技術(shù)核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒有效解決了ELISA漏檢的問題,達(dá)到了檢測葉片、組培苗或薯塊,一個反應(yīng)具有可同時檢測多種病毒、檢測時間短、操作簡便、易于推廣等特點。目前,馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術(shù)在馬鈴薯種薯質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用剛剛起步,該產(chǎn)品在歐洲市場已進(jìn)入試用階段。該技術(shù)現(xiàn)已得到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視,因此馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術(shù)在馬鈴薯種薯生產(chǎn)和質(zhì)量控制體系中具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

      5 參考文獻(xiàn)

      [1] 谷宇.馬鈴薯病毒與類病毒檢測芯片的制備及應(yīng)用[D].南京:東南大學(xué),2004.

      [2] 吳明煜,郭曉紅,王萬賢,等.生物芯片研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2005(7):421-430.

      [3] 楊小琴,張艷艷,張媛媛,等.馬鈴薯病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(24):148-149.

      [4] SHENA M,SHALON D,DAVIS R W,et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray[J].Scie-nce,1995,270:464-470.

      [5] HADIDI A,CZOSNEK H,BARBA M.DNA microarrays and their poten-tial applications for the detection of plant viruses,viroids,and phytopl-asmas[J].Plant Pathol,2004,86:97-104.

      [6] BYSTRICKA D,LENZ 0,MIAZ I,et al.DNA microarray:parallel detect-ion of potato viruses[J].Acta Virol,2003,47:41-44.

      [7] BOONHAM N,WALSH K,SMITH P,et al.Detection of potato viruses u-sing microarray technology:towards a generic method for plant viral disease diagnosis[J].Viral Methods,2003,108:181-187.

      [8] 李子芳.中國馬鈴薯主要病害圖鑒[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004.(上接第104頁)

      檢測葉片、組培苗和種薯塊莖中是否攜帶病毒,有效解決了ELISA只檢測葉片或薯塊,不能檢測類病毒的問題,以生物芯片檢測為技術(shù)核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒比傳統(tǒng)RT-PCR檢測具有以幾個方面的優(yōu)點:時間短、準(zhǔn)確度和靈敏度高,擴(kuò)充性與多重檢測效果好,所用試劑無毒害、檢測結(jié)果肉眼可判讀,操作簡便,易于推廣。genetop馬鈴薯病毒試劑盒量化檢測時,平均價格低于ELISA,該試劑盒的推廣有助于馬鈴薯種薯病毒檢測的效率和質(zhì)量提升,操作步驟簡單,易在基層種薯監(jiān)控單位和種薯繁育企業(yè)推廣。

      4 genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯種薯質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用前景

      我國馬鈴薯種植面積54.32萬hm2,面積位居世界首位,產(chǎn)量水平較低(15 818 kg/hm2),是發(fā)達(dá)國家產(chǎn)量水平的1/3~1/2,我國馬鈴薯產(chǎn)量遠(yuǎn)低于世界平均水平(2012年FAO數(shù)據(jù))。影響我國馬鈴薯產(chǎn)量的主要因素是病毒病危害,研究證明馬鈴薯病毒引起馬鈴薯減產(chǎn)10%~30%,如果不同病害混合侵染,可以造成50%~80%以上的產(chǎn)量損失[8]。利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得脫毒復(fù)壯種薯,可從根本上解決這一問題,種薯的質(zhì)量是影響馬鈴薯產(chǎn)量的重要因素。目前,我國大面積推廣應(yīng)用的DAS-ELISA檢測技術(shù)只能檢測試管苗或植株,不能對原原種、原種和一級種薯塊莖進(jìn)行直接快速檢測[3]。特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、成本低的病毒檢測技術(shù)的缺乏是是限制馬鈴薯種薯市場瓶頸。以生物芯片檢測為技術(shù)核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒有效解決了ELISA漏檢的問題,達(dá)到了檢測葉片、組培苗或薯塊,一個反應(yīng)具有可同時檢測多種病毒、檢測時間短、操作簡便、易于推廣等特點。目前,馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術(shù)在馬鈴薯種薯質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用剛剛起步,該產(chǎn)品在歐洲市場已進(jìn)入試用階段。該技術(shù)現(xiàn)已得到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視,因此馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術(shù)在馬鈴薯種薯生產(chǎn)和質(zhì)量控制體系中具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

      5 參考文獻(xiàn)

      [1] 谷宇.馬鈴薯病毒與類病毒檢測芯片的制備及應(yīng)用[D].南京:東南大學(xué),2004.

      [2] 吳明煜,郭曉紅,王萬賢,等.生物芯片研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2005(7):421-430.

      [3] 楊小琴,張艷艷,張媛媛,等.馬鈴薯病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(24):148-149.

      [4] SHENA M,SHALON D,DAVIS R W,et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray[J].Scie-nce,1995,270:464-470.

      [5] HADIDI A,CZOSNEK H,BARBA M.DNA microarrays and their poten-tial applications for the detection of plant viruses,viroids,and phytopl-asmas[J].Plant Pathol,2004,86:97-104.

      [6] BYSTRICKA D,LENZ 0,MIAZ I,et al.DNA microarray:parallel detect-ion of potato viruses[J].Acta Virol,2003,47:41-44.

      [7] BOONHAM N,WALSH K,SMITH P,et al.Detection of potato viruses u-sing microarray technology:towards a generic method for plant viral disease diagnosis[J].Viral Methods,2003,108:181-187.

      [8] 李子芳.中國馬鈴薯主要病害圖鑒[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004.

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