余進(jìn)

(北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京市皮膚病分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

·述評(píng)·

真菌檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展

余進(jìn)

(北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京市皮膚病分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

真菌檢驗(yàn)技術(shù)主要包括傳統(tǒng)的真菌涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、血清學(xué)檢查、分子生物學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)。近年來，在臨床需求的促進(jìn)下，真菌檢驗(yàn)技術(shù)的開展受到重視。傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化和改良，新技術(shù)日益推廣應(yīng)用，分子生物學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)持續(xù)研發(fā)，變革帶來的成果有目共睹。該文對(duì)近年來重要的真菌檢驗(yàn)新技術(shù)(真菌涂片熒光染色技術(shù)、血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)中抗體檢測、抗原檢測和真菌細(xì)胞壁葡聚糖檢測)的應(yīng)用以及分子生物學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

真菌感染；檢驗(yàn)技術(shù)；進(jìn)展

近年來，真菌感染日益受到人們重視。深部真菌感染病例逐漸增多，臨床醫(yī)生對(duì)真菌檢驗(yàn)的需求和依賴也越來越高。這些來自于臨床的需求進(jìn)一步促進(jìn)了傳統(tǒng)真菌檢驗(yàn)技術(shù)的提高并且推進(jìn)了新技術(shù)的應(yīng)用。真菌檢驗(yàn)技術(shù)主要包括傳統(tǒng)的真菌直接涂片鏡檢、真菌培養(yǎng)、真菌鑒定、組織病理學(xué)檢查以及新型的血清學(xué)檢測、分子生物學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)。真菌涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)是真菌檢驗(yàn)的基礎(chǔ)，目前仍有重要價(jià)值，不能忽視。真菌檢驗(yàn)新技術(shù)推廣迅速，但也存在一些無法回避的問題，需要充分認(rèn)識(shí)。本文介紹了涂片鏡檢、形態(tài)鑒定、血清學(xué)方法、PCR技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)在真菌學(xué)檢測中的應(yīng)用及進(jìn)展。

1 真菌涂片鏡檢技術(shù)

真菌涂片鏡檢技術(shù)操作簡單，結(jié)果直觀，能夠快速報(bào)告，是真菌檢驗(yàn)的基本技術(shù)。真菌涂片一般采用1.78 mol/L KOH溶液制片，KOH能夠溶解人體細(xì)胞，但對(duì)真菌無染色強(qiáng)化作用，需要操作者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判讀結(jié)果，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性或者假陽性情況。KOH溶液可以用于甲屑、毛發(fā)等標(biāo)本的檢測。某些體液標(biāo)本，比如痰液較黏稠時(shí)也可使用KOH溶液作為載浮液進(jìn)行涂片觀察。乳酸酚棉藍(lán)染料可將真菌成分染成藍(lán)色，一般用于對(duì)培養(yǎng)后菌種進(jìn)行觀察，也可以和1.78 mol/L KOH溶液混合后用于真菌直接涂片檢查。墨汁染色主要用于腦脊液標(biāo)本的隱球菌篩查。對(duì)直接涂片標(biāo)本進(jìn)行革蘭染色可以發(fā)現(xiàn)放線菌，諾卡菌等細(xì)菌以及念珠菌、隱球菌等酵母菌。絲狀真菌一般為革蘭陰性。熒光染色技術(shù)使用特殊的熒光染料，可以特異性結(jié)合真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和葡聚糖，在熒光顯微鏡下熒光標(biāo)記的真菌易于觀察，形態(tài)清晰，提高了真菌鏡檢的敏感性[1]，適用于目前發(fā)現(xiàn)的各種致病真菌的直接涂片檢查。基于鏡下真菌形態(tài)特征，還可以進(jìn)一步對(duì)致病真菌種類進(jìn)行提示性診斷，更具臨床價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，真菌涂片熒光染色適用于多種標(biāo)本，除了常規(guī)的痰、尿、便、皮屑、甲屑、各種體液標(biāo)本以外，對(duì)于組織標(biāo)本也可以直接壓片染色，同樣可以觀察到真菌成分。

2 血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)包括抗體檢測、抗原檢測和真菌細(xì)胞壁葡聚糖檢測。

2.1抗體檢測 一般應(yīng)用于免疫正常人體或免疫基本正常人群，而明顯免疫抑制患者可能由于抗體滴度過低檢測不到。目前抗體檢測主要用于組織胞漿菌病、球孢子菌病、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病和慢性壞死性肺曲霉病中，而對(duì)易于出現(xiàn)侵襲性肺曲霉病、念珠菌病和隱球菌病的免疫功能明顯受損人群則應(yīng)用意義不如抗原檢測。組織胞漿菌抗體檢測方法有免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(immunodiffusion,ID)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(conplement fixation,CF)2種方法：ID試驗(yàn)針對(duì)組織胞漿菌M抗原(一種過氧化氫酶)和H抗原(β-葡萄糖苷酶)，一般2個(gè)抗體都陽性時(shí)有診斷意義[2]；CF方法比ID方法更敏感，但交叉反應(yīng)較多見。球孢子菌抗體檢測的方法包括ID、CF和酶聯(lián)免疫分析法(EIA)：ID試驗(yàn)檢測IgM類抗體(針對(duì)β-葡萄糖苷酶抗原)，在感染早期出現(xiàn)；CF試驗(yàn)檢測IgG類抗體(針對(duì)幾丁質(zhì)酶抗原)，可以用于急性、慢性感染的診斷以及預(yù)后判斷；EIA方法具有更高的靈敏度，可以作為疾病篩查方法，用于疾病診斷時(shí)需要其他方法輔助[3]。變應(yīng)性支氣管肺曲霉病患者可檢測曲霉特異的IgE類抗體。慢性肺曲霉病主要繼發(fā)于既往肺部疾病患者，例如肺結(jié)核出現(xiàn)肺部空洞的患者，這類患者曲霉特異性IgG類抗體出現(xiàn)升高，檢測曲霉特異性IgG可用于輔助診斷[4]。

2.2抗原或者真菌細(xì)胞壁成分檢測 包括曲霉半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)抗原、隱球菌抗原、念珠菌抗原和細(xì)胞壁1，3-β-D-葡聚糖檢測。這些檢測主要針對(duì)免疫受損人群出現(xiàn)的條件致病真菌感染，對(duì)于高危患者的早期診斷和治療監(jiān)測有重要價(jià)值，但在應(yīng)用中也存在一些局限性。

GM是曲霉細(xì)胞壁的組成成分，可溶于液體，在培養(yǎng)過濾液、血液、支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolus lavage fluid, BALF)等體液中均可檢測到。GM具有抗原性的成分是β(1-5)呋喃半乳糖殘基。目前檢測試劑盒是通過EB-A2單克隆抗體與GM抗原結(jié)合，采用雙抗體夾心ELISA方法。GM抗原檢測可以早期輔助診斷侵襲性曲霉病，這一指標(biāo)已經(jīng)作為重要的微生物學(xué)證據(jù)列入EORTC/MSG2008年修訂的侵襲性曲霉病診斷標(biāo)準(zhǔn)中[5]。血清GM檢測(GM試驗(yàn))在不同人群中應(yīng)用價(jià)值也存在差異：骨髓移植患者、血液系統(tǒng)惡性病這類侵襲性肺曲霉病高發(fā)人群應(yīng)用價(jià)值較高，而在實(shí)體器官移植患者和 ICU患者中敏感度下降[6]。GM抗原檢測不僅可以用于患者血清，也可以檢測BLAF。在血液系統(tǒng)惡性病、造血干細(xì)胞移植患者中，BALF中GM值的升高能夠提高侵襲性肺曲霉病診斷的靈敏度。對(duì)于非血液病患者，BALF也能顯著提高診斷的效率。我中心曾比較BALF和血清GM試驗(yàn)在非血液病人群的診斷價(jià)值，研究顯示BALF更為敏感，敏感性達(dá)85.4%，同時(shí)血清GM試驗(yàn)的敏感性為67.9%[7]。盡管提高了靈敏度，BALF更容易出現(xiàn)假陽性。BALF GM的診斷界值至今沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但不可否認(rèn)其仍具有重要價(jià)值。

隱球菌莢膜多糖抗原檢測主要有3種方法，乳膠凝集法(LA)、EIA和膠體金免疫沉淀法(LFA)。三者對(duì)隱球菌病診斷價(jià)值均較高。其中LFA是2009年Immuno-Mycologics(IMMY)公司推出的診斷試劑， 操作更為簡便，反應(yīng)時(shí)間縮短到10 min，結(jié)果更客觀，可進(jìn)行定性和半定量檢測。將EIA和LFA進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，二者一致性為 97%，LFA更敏感，對(duì)于隱球菌病診斷的敏感性和特異性分別為100%和99.6%[8]。隱球菌病最常見于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，即隱球菌性腦膜炎。在2008年EROCT/MSG侵襲性真菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)中，腦脊液莢膜多糖抗原陽性可以作為隱球菌性腦膜炎確診證據(jù)。在肺隱球菌病中，血清莢膜多糖抗原陽性同樣具有很高的敏感性和特異性[9]，假陰性出現(xiàn)于抗原滴度低于檢測限、感染菌株缺乏莢膜等情況，有時(shí)抗原濃度過高也可以出現(xiàn)假陰性，稱為“前帶效應(yīng)”，需要稀釋后再次檢測。莢膜多糖抗原檢測除了可以用于腦脊液和血清的檢測外，也可以用于尿標(biāo)本[10]。

念珠菌抗原檢測主要針對(duì)3種抗原成分：(1)念珠菌細(xì)胞壁上的甘露聚糖和甘露聚糖蛋白；(2)念珠菌烯醇化酶；(3)念珠菌特異的一組熱敏感循環(huán)抗原。其中甘露聚糖抗原應(yīng)用較多。甘露聚糖蛋白是念珠菌細(xì)胞壁外層的主要可溶性抗原成分，血液中一過性存在，免疫正常宿主很快清除，免疫抑制者清除減慢。甘露聚糖抗原檢測特異性較好，但敏感性相對(duì)較低，在特殊人群中例如粒細(xì)胞缺乏或者ICU患者中敏感性提高。針對(duì)甘露聚糖，相應(yīng)抗體檢測試劑盒的診斷敏感性提高，但特異性較差，在念珠菌定植時(shí)容易出現(xiàn)假陽性。目前推薦聯(lián)合應(yīng)用甘露聚糖抗原和抗體檢測。一般甘露聚糖抗原陽性出現(xiàn)早，甘露聚糖抗體陽性出現(xiàn)晚，二者不同時(shí)升高。對(duì)于粒細(xì)胞減少者，甘露聚糖抗原和抗體的診斷界值均下調(diào)，對(duì)于血液病房和ICU患者，更易出現(xiàn)甘露聚糖抗原陽性，對(duì)于外科病房患者甘露聚糖抗體陽性更常見[11]。

1,3-β-D-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分之一，多種真菌(接合菌和隱球菌除外)的細(xì)胞壁都具有這一成分，而其他微生物、動(dòng)物及人的細(xì)胞不含該成分。1,3-β-D-葡聚糖可以釋放入血，逐漸被清除，免疫受損人群清除較慢，可以作為侵襲性真菌感染的早期診斷標(biāo)志。1,3-β-D-葡聚糖檢測可以用來診斷念珠菌、曲霉、鐮刀菌、毛孢子菌、枝頂孢、暗色真菌、肺孢子菌等感染，但是不能區(qū)分感染真菌的種類，檢測中會(huì)遇到假陽性和假陰性問題。近年來，我國出現(xiàn)若干針對(duì)葡聚糖檢測的國產(chǎn)試劑，在應(yīng)用中存在一些不足，比如缺少大樣本、不同高危因素人群應(yīng)用方面的研究。整體研究試驗(yàn)中確診病例少，總敏感性60%～70%，特異性70%～90%，陰性預(yù)測值較高，除外的意義更大；高危人群(血液病化療后、移植患者)陽性預(yù)測值較高，對(duì)于一般住院患者則較低[12]。

3 分子生物學(xué)技術(shù)

將分子生物學(xué)技術(shù)用于致病真菌的核酸檢測一直是研究熱點(diǎn)。分子生物學(xué)從出現(xiàn)至今，技術(shù)方面已經(jīng)發(fā)展成熟。其用于感染診斷的優(yōu)勢(shì)顯著，無論是在檢測速度、檢測敏感性、特異性，還是鑒定種屬、耐藥基因檢測方面都是傳統(tǒng)真菌鏡檢、培養(yǎng)和血清學(xué)方法難以達(dá)到的。

用于分子診斷的標(biāo)本包括血液、BALF以及組織等。實(shí)驗(yàn)室研究中多采用實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)或者巢式PCR方法，針對(duì)臨床相對(duì)常見的念珠菌、曲霉和毛霉等開發(fā)特異性引物或者探針。我實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)94名懷疑侵襲性肺曲霉病(IPA)患者同時(shí)收集BALF和血清進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR和GM檢測，BALF檢測中，實(shí)時(shí)PCR檢測特異性優(yōu)于GM試驗(yàn)；血清檢測中，GM試驗(yàn)和實(shí)時(shí)PCR二者敏感性和特異性相當(dāng)[13]。

隨著實(shí)驗(yàn)室研究的進(jìn)展，商品化分子檢測方法也逐漸出現(xiàn)，包括PCR-測序 (PCR-sequencing, 如MicroSeq, Applied Biosystems)[14]。PCR-微芯片(PCR-microarray, 如Luminex xMAP technology)[15]、PCR-核磁共振分析(PCR-magnetic resonance assay, T2Dx, T2 Biosystems)[16]、PCR-電噴霧電離質(zhì)譜法(PCR-electrospray ionization mass spectrometry, Abbott IRIDICA，Abbott Molecular )[17]。但是，這些方法也存在問題，例如Micro-Seq和PCR-microarray均只能檢測無菌樣本，容易污染。核磁分析可以檢測血液標(biāo)本，但是儀器昂貴，檢測真菌種類有限。電噴霧電離質(zhì)譜法可以檢測BALF，但儀器價(jià)格昂貴。到目前為止，真正推廣應(yīng)用的商品化真菌分子檢測方法鳳毛麟角，主要與樣本中真菌核酸載量低、樣本污染、DNA提取和分子檢測標(biāo)準(zhǔn)化問題以及臨床意義有關(guān)。

4 質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜( matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)可以檢測生物大分子，在微生物鑒定領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。MALDI-TOF MS可以快速鑒定細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌，方法相對(duì)簡便，耗時(shí)短，結(jié)果的準(zhǔn)確性高，越來越受到檢驗(yàn)工作者的青睞。在真菌鑒定中，酵母菌鑒定比較成熟，可以達(dá)到90%以上的準(zhǔn)確性[18]。絲狀真菌鑒定不斷發(fā)展，逐漸規(guī)范了培養(yǎng)和蛋白質(zhì)提取方法，數(shù)據(jù)庫也日益完善，鑒定的準(zhǔn)確性也越來越高。MALDI-TOF MS除用于真菌鑒定外，還可以對(duì)某些樣本進(jìn)行直接檢測，例如血培養(yǎng)陽性的標(biāo)本或者尿液。主要涉及細(xì)菌鑒定，其中血培養(yǎng)念珠菌陽性的標(biāo)本也可以檢測[19]。直接檢測受到菌量、是否單一致病菌以及其他細(xì)胞成分的影響，仍需深入研究。

MALDI-TOF MS技術(shù)還可以用于細(xì)菌毒力、耐藥性和耐藥機(jī)制研究，這些應(yīng)用多集中于細(xì)菌，但是隨著技術(shù)的成熟必然會(huì)推廣到真菌。目前，已經(jīng)出現(xiàn)采用MALDI-TOF MS對(duì)真菌藥物敏感性進(jìn)行檢測。其應(yīng)用依賴于在不同藥物濃度下真菌表達(dá)的蛋白質(zhì)譜差異。Marinach等[20]研究氟康唑?qū)δ钪榫拿舾行?，采用念珠菌出現(xiàn)質(zhì)譜圖改變的最小藥物濃度(MPCC)作為指標(biāo)。而另一項(xiàng)研究念珠菌和曲霉對(duì)棘白菌素類藥物敏感性的研究中采用擬合相關(guān)指數(shù)(composite correlation index，CCI)作為指標(biāo)[21]。MALDI-TOF MS用于藥敏檢測的優(yōu)勢(shì)在于可以快速發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，但是涉及藥物種類有限，仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

5 真菌的形態(tài)學(xué)檢查

致病真菌可以分為兩類，(類)酵母菌和絲狀真菌，其中絲狀真菌的形態(tài)多樣，具有明顯的種屬特征。對(duì)絲狀真菌形態(tài)特征的掌握可以幫助快速鑒定菌種。形態(tài)鑒定包括菌落的大體形態(tài)和顯微鏡下表現(xiàn)。真菌在不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)溫度下的表現(xiàn)存在差異，所以觀察形態(tài)時(shí)要采用標(biāo)準(zhǔn)或常用的真菌培養(yǎng)基，一般為馬鈴薯瓊脂或沙氏瓊脂，培養(yǎng)溫度為28 ℃左右。很多致病絲狀真菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)僅能觀察到其無性生殖狀態(tài)，根據(jù)其無性孢子的發(fā)生方式進(jìn)行描述鑒定。產(chǎn)孢方式一般分為芽生和絲裂2種，芽生中包括瓶梗、環(huán)痕、合軸和同步產(chǎn)孢；絲裂中包括全絲裂、全分節(jié)和內(nèi)分節(jié)，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的粉孢子和節(jié)孢子。很多真菌還可以在菌絲中間或末端產(chǎn)生厚壁孢子。這些特征都有助于鑒定菌種。我們?cè)趯W(xué)習(xí)形態(tài)學(xué)特征鑒定的同時(shí)，一定要認(rèn)識(shí)到致病真菌種類繁多，新發(fā)致病菌種層出不窮，形態(tài)表現(xiàn)也千變?nèi)f化，僅僅依靠形態(tài)學(xué)來鑒定菌種存在很大的局限性。隨著我們對(duì)真菌認(rèn)識(shí)的日益加深，復(fù)合群越來越多，這些復(fù)合群中的菌種沒有形態(tài)差異或者差異很小，所以分子鑒定更加準(zhǔn)確可靠。分子鑒定結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查是真菌鑒定的發(fā)展趨勢(shì)。

6 結(jié)語

真菌檢驗(yàn)屬于微生物檢驗(yàn)的一部分，在病原學(xué)診斷中占有重要地位，早期快速、準(zhǔn)確可靠的真菌感染診斷對(duì)臨床幫助巨大。理想的檢驗(yàn)方法應(yīng)更敏感、準(zhǔn)確，并且操作簡便，未來真菌檢驗(yàn)必然向著這一方向發(fā)展。技術(shù)的進(jìn)步為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了可能。未來我們將更加依賴分子技術(shù)，無論是DNA還是蛋白質(zhì)，都有可能成為新的分子標(biāo)記。二代測序技術(shù)的不斷完善也將大大提高檢測的敏感性。從歷史的角度來看，沒有任何一種技術(shù)是萬能的，我們寄希望于新技術(shù)帶來革命性改變的同時(shí)，仍要關(guān)注傳統(tǒng)技術(shù)的改良，熒光染色涂片就是一個(gè)范例。未來人工智能的發(fā)展也許能夠解決形態(tài)學(xué)檢查的困境。

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2017-03-02)

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.01

余進(jìn)，1974年生，女，主任醫(yī)師，博士，從事真菌和真菌病研究。

R446.5

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