鄔升超，郭瑋，潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032)

·專家論壇·

腫瘤細胞來源的外泌體在結(jié)直腸癌中的研究進展*

鄔升超，郭瑋，潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032)

外泌體(exosome)作為目前液體活檢領(lǐng)域中研究的熱點已被證實可參與多種生物學(xué)的過程。其所包含的大量核酸如DNA、RNA以及大分子如脂類和蛋白質(zhì)等，均可以外泌體為載體通過控制微血管生成、調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞、重鑄細胞外基質(zhì)以及建立“預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境”等多種途徑，從而促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。該文以腫瘤細胞來源的外泌體為主要對象，介紹外泌體及其分離技術(shù)，并對其在結(jié)直腸癌中的研究進展進行分析及論述。

結(jié)直腸癌；外泌體；細胞外囊泡；miRNAs；蛋白質(zhì)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)屬于臨床常見的惡性腫瘤，手術(shù)切除是最有效的治療方式，但鑒于CRC起病隱匿，通常發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，絕大部分患者由此失去最佳治療時機。雖然傳統(tǒng)化療或者分子靶向治療對于CRC患者部分有效，但最終均會受到諸如耐藥和藥物毒性等因素的影響，從而縮短了生存時間，生存質(zhì)量也無法獲得保障。因此深入理解CRC的發(fā)生與發(fā)展、靶向及化療治療耐藥產(chǎn)生的機制，從中篩選出具有價值的標(biāo)志物將有助于在預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后評估等環(huán)節(jié)中為臨床決策提供參考。

早在20世紀(jì)80年代，外泌體(exosome)被用于指代來自于網(wǎng)織紅細胞分化過程中由多囊核內(nèi)體或者多囊小體與細胞膜融合后所形成的核內(nèi)來源的小囊泡。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，這些由細胞分泌的囊泡被證明可參與生理以及病理過程，細胞外囊泡受到越來越多的關(guān)注。其中物理性質(zhì)相對均一、分離技術(shù)成熟的外泌體，更是成為目前研究的熱點。游離于外周血的外泌體不僅僅來自于腫瘤細胞、包括血小板、有核細胞、基質(zhì)細胞等非腫瘤細胞均可分泌外泌體。目前針對外泌體的研究涵蓋了包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌和肝癌等常見癌種，不同來源的外泌體均被證實可參與到腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)以及耐藥發(fā)生等多個領(lǐng)域[1-3]。同時外泌體還可被用作藥物治療的載體，有望成為一種全新的分子治療手段[4-5]。本文將以“腫瘤細胞來源的外泌體”為主要敘述對象，對其在CRC中的相關(guān)研究成果進行分析及論述。

1 外泌體的形成、分類及主要內(nèi)容物

細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)根據(jù)其直徑大小從高到低依次分為凋亡小體(1～5 μm)、微囊泡(100 nm～1 μm)和外泌體(40～100 nm)。上述3類細胞外囊泡除了在大小上存在差異外，在形態(tài)、內(nèi)容物、釋放的機制等均各不相同，目前該領(lǐng)域研究最為廣泛的是外泌體。外泌體在細胞中經(jīng)過細胞膜內(nèi)陷、多囊泡體(multivesicular body, MVB)形成、MVB與細胞膜的融合等步驟從供體細胞中分離。之后游離的外泌體通過與受體細胞質(zhì)膜的融合、內(nèi)吞或與細胞表面受體結(jié)合的方式進入受體細胞[6]。外泌體可通過將包含在其中的DNA、mRNA、miRNAs、短肽以及蛋白質(zhì)等內(nèi)容物釋放入受體細胞，從而構(gòu)建起供體與受體細胞之間的互相聯(lián)系。來自腫瘤細胞的外泌體可特異性的表達膜表面蛋白質(zhì)標(biāo)志物，包括核內(nèi)相關(guān)蛋白(如Rab家族GTP酶, 膜聯(lián)蛋白和鞭毛蛋白)，與外泌體生物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)(如Alix、Tsg101和ESCRT復(fù)合物)，四分子交聯(lián)體家族(如CD9、CD37、CD53、CD63、CD81h和CD82)，熱休克蛋白(Hsp70和Hsp90)以及上皮細胞黏附分子(EpCam)。因此通過分析內(nèi)容物中特定蛋白質(zhì)或核酸的水平，采用基于質(zhì)譜的分離或者包被有特定抗體的磁珠或者芯片對外泌體表面分子進行分選，可輔助腫瘤的診斷、為判斷腫瘤原發(fā)位置提供依據(jù)[1,3,7-9]。

2 外泌體的分離和保存

目前常見的外泌體分離方法分為基于超速離心的實驗室自建方法和非基于超速離心的商業(yè)化試劑兩大類[10-11]。超速離心法是最為經(jīng)典的外泌體分離方法，利用超速離心機通過多步離心可有效從血清/血漿中分離出外泌體。但實際應(yīng)用中，由于該方法操作復(fù)雜、耗時且依賴特殊的儀器，一定程度上限制了其未來進入大規(guī)模臨床應(yīng)用的前景。相比較之下，目前市場上常見的商業(yè)化試劑盒通過免疫結(jié)合沉淀、磁珠法和聚乙二醇法[12]等成功規(guī)避上述問題，優(yōu)化了操作步驟的同時所獲取的外泌體質(zhì)量并不遜于傳統(tǒng)方法。Helwa等[13]的研究結(jié)果顯示，對不同水平的起始樣本量分別進行測試，無論以外泌體的大小分布情況、外泌體內(nèi)RNA(mRNA和miRNAs)的產(chǎn)量和質(zhì)量，還是表面蛋白質(zhì)標(biāo)志物的表達作為評估標(biāo)準(zhǔn)，商品化試劑盒對外泌體的分離性能均等同于超速離心法。

分離后的外泌體如果需要進行后續(xù)DNA或RNA的抽提，可根據(jù)需求選用對應(yīng)的試劑盒。但外泌體的合理保存將直接影響到后續(xù)抽提工作最終獲得的樣本濃度。37 ℃環(huán)境下，使用超濾法或者超速離心法獲得的外泌體約2 h就會發(fā)生降解并開始釋放內(nèi)容物[14]。文獻報道，使用ExoQuick試劑盒進行抽提，最終獲得的外泌體即使在-80 ℃的環(huán)境下僅可在18 h內(nèi)維持穩(wěn)定狀態(tài)[15]。因此，對于外泌體的保存盡可能以最終目的模板的形式，如需完整的外泌體，高速離心法進行分離配合-80 ℃凍存可能是更好的選擇。

3 外泌體在CRC中的應(yīng)用

大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體可通過控制微血管生成、調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞、重鑄細胞外基質(zhì)以及建立“預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境”等多種途徑，從而促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[16-18]。不僅僅限于腫瘤來源的外泌體，包括血小板、成纖維細胞以及基質(zhì)細胞等非腫瘤細胞來源的外泌體，同樣可進入腫瘤細胞釋放內(nèi)容物從而調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲、耐藥乃至改變腫瘤微環(huán)境中的免疫系統(tǒng)[19-21]。外泌體調(diào)控靶細胞主要通過包裹在磷脂雙層內(nèi)的內(nèi)容物作用于靶標(biāo)。進入細胞質(zhì)后，外泌體釋放出種類豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA(mRNA、miRNAs、circRNAs和lncRNAs等)。

3.1 CRC細胞來源外泌體所分泌的蛋白質(zhì) 外泌體相關(guān)的蛋白質(zhì)可根據(jù)來源分為兩大類：外泌體特異性與親代細胞特異性。腫瘤細胞分泌的外泌體中包含大量外泌體特異的蛋白質(zhì)，包括：內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運裝置(ESCRT)、四分子交聯(lián)體家族成員9(TM4SF9)、轉(zhuǎn)運相關(guān)和細胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)。由于外泌體是在細胞內(nèi)進行裝配合成，因此其中還囊括了大量親代細胞的蛋白質(zhì)。Mathivanan等[22]對CRC細胞系LIM1215的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果證實外泌體中包含的如A33、cadherin-17、CEA、上皮細胞表面抗原(EpCAM)、增殖細胞核心抗原和表皮生長因子受體等均為親代細胞特異性。除了不同的親代細胞類型，來自外界環(huán)境的刺激也會對細胞所分泌外泌體中蛋白質(zhì)與miRNAs的水平和種類產(chǎn)生影響。Ragusa等[23]使用西妥昔單抗分別處理的Caco-2(西妥昔單抗敏感)和HCT-116(西妥昔單抗抵抗)CRC細胞系，結(jié)果出現(xiàn)了不同的miRNAs以及蛋白質(zhì)譜。

對于實體腫瘤而言，腫瘤的異質(zhì)性使得在腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞間以及腫瘤細胞與非腫瘤細胞間的溝通變得極為復(fù)雜，以外泌體為工具進行“交流”的方式可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[18,24-28]。Demory Beckler等[27]采用LC-MS/MS對結(jié)腸癌細胞DKs-8(野生型)、DKO-1(雜合突變型)和DLD-1(純合突變型)所釋放的外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，攜帶有KRASG13D突變等位基因的外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果與野生型存在明顯差異。將DKO-1所分泌的外泌體與DKs-8共培養(yǎng)后，使用western blot可在DKs-8細胞中檢測出KRASG13D突變短肽，同時體外實驗也證實共培養(yǎng)后的DKs-8細胞的三維生長能力明顯提升，提示在腫瘤微環(huán)境中不同細胞間可通過外泌體作為有效的“溝通”工具，增加腫瘤細胞的侵襲能力。Chen等[26]同樣證明 CRC患者血清來源的外泌體在促進腫瘤侵襲性的過程中起到關(guān)鍵作用，但對腫瘤細胞的生存和增殖的影響是有限的。Ji等[18]采用OptiPrepTM密度梯度分離的方法獲取外泌體后，使用 GeLC-MS/MS分析分別來自于原發(fā)(SW420)和轉(zhuǎn)移(SW480)的人CRC細胞系來源的外泌體。結(jié)果顯示來自于轉(zhuǎn)移性CRC細胞的外泌體可選擇性富集涉及轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵分子以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。同時在兩種細胞系來源的外泌體內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)促進腫瘤生成的EPCAM-CLDN7復(fù)合物以及調(diào)節(jié)細胞骨架重塑的TNIK-RAP2A復(fù)合物。

腫瘤細胞同樣可通過外泌體改變腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞的表型，進而抑制免疫細胞的正常功能。對于許多惡性腫瘤患者，腫瘤微環(huán)境中或者外周血中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs細胞)數(shù)量的升高提示存在腫瘤免疫耐受的狀態(tài)，預(yù)后較差。Yamada等[29]發(fā)現(xiàn)CRC細胞系來源的外泌體中高表達TGF-β1，而TGF-β1可促進Tregs細胞的產(chǎn)生。其認為正是TGF-β1激活TGF-β/Smad信號通路的同時沉默SAPK通路，導(dǎo)致T細胞向Treg樣細胞的轉(zhuǎn)變。

3.2 CRC細胞來源外泌體所分泌的miRNAs miRNAs是一類長約15～23 bp短單鏈RNA序列，現(xiàn)已知的mRNAs可調(diào)控50%以上可編碼蛋白質(zhì)的基因表達。miRNAs與靶mRNA 3′UTR特定區(qū)域的特異性結(jié)合，通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平從而起到對受體細胞生物調(diào)節(jié)的作用。異常表達的特定miRNAs可作為許多腫瘤的潛在的標(biāo)志物應(yīng)用于包括診斷、預(yù)后和療效評估等領(lǐng)域。

游離在外周血中的大量miRNAs可來源于壞死的腫瘤和細胞，同樣還包括不同類型的細胞所分泌的外泌體，有研究認為血清中miRNAs主要來源于外泌體。雖然目前無法完全闡明血清中miRNAs的主要來源，但是利用細胞系對外泌體中所包含miRNAs譜的分析將有助于理解腫瘤微環(huán)境中細胞間互相作用的機制。Ji等[30]使用第二代測序技術(shù)對來源于CRC細胞系LIM1863所分泌的細胞微囊泡和2個外泌體亞群(A33+和EpCAM+外泌體)中的miRNAs進行分析。結(jié)果顯示上述每類微囊泡的miRNAs譜都是獨特的，且根據(jù)細胞系不同miRNAs的分布情況也有不同。該結(jié)果同樣在其他研究中被證實包括KRAS突變和藥物治療均會引起外泌體miRNAs譜的差異[23,31]。

肝轉(zhuǎn)移是晚期CRC患者最常見的血行轉(zhuǎn)移方式。其中15%～25% CRC患者于診斷時即可發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，另有15%～25%的患者將在原發(fā)灶根治術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，其中絕大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移灶無法獲得根治性切除，導(dǎo)致肝轉(zhuǎn)移成為晚期結(jié)直腸癌患者的主要死因之一。因此理解CRC的轉(zhuǎn)移機制，尋找合理的治療靶點具有重大意義。2017年，Teng等[32]發(fā)現(xiàn)MVP可與miR-193a構(gòu)成復(fù)合物，完成將miRNAs從腫瘤細胞裝配入外泌體的過程。其通過研究證實在敲除MVP基因的結(jié)腸癌細胞中，具有腫瘤抑制作用的miR-193a在細胞內(nèi)積聚，miR-193a以Caprin-1 mRNA為靶標(biāo)通過抑制其蛋白質(zhì)的合成，最終抑制腫瘤細胞的生長。可見具有選擇性的外泌體miRNAs裝配過程將影響腫瘤細胞的侵襲能力，作為介導(dǎo)miRNAs轉(zhuǎn)運的核心MVP或許可成為一個全新的治療靶點。Bigagli等[33]通過體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞系HCT-8，發(fā)現(xiàn)包含有miR-210的外泌體可通過在原位維持腫瘤生長的自由環(huán)境從而促進EMT的發(fā)生，同時引導(dǎo)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。

CRC外泌體miRNAs在臨床的應(yīng)用目前主要涉及診斷和預(yù)后判斷領(lǐng)域。Ogatakawata等[34]使用微列陣分析血清中外泌體miRNAs譜，篩選得到包括let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a在內(nèi)的7個miRNAs在CRC患者中的表達水平均明顯高于健康人，且在5種常見CRC細胞系(HCT116、HT-29、RKO、SW48和SW480)驗證中得到同樣的結(jié)果，因此該miRNAs組合可應(yīng)用于CRC的診斷。在Uratani等[35]的研究中，miR-21還可被用于區(qū)別結(jié)腸腺瘤患者與健康人。除了在診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，Matsumura等[36]發(fā)現(xiàn)來自血清外泌體的miR-19a可作為CRC患者疾病復(fù)發(fā)的預(yù)后指標(biāo)。對于早期CRC患者(Ⅱ期和Ⅲ期)，miR-4772-3p同樣可作為疾病復(fù)發(fā)的預(yù)后指標(biāo)，且低miR-4772-3p水平的患者在接受FOLFOX輔助治療后疾病的復(fù)發(fā)概率更高(9/10 vs 10/56,P<0.01)[37]，提示其還可能作為治療反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)。

3.3 其他標(biāo)志物 除miRNAs外，其他非編碼RNA在外泌體中也有分布并認為可能參與到腫瘤相關(guān)的進程。LncRNAs是一類片段長度大于200個堿基且不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA，在腫瘤的發(fā)生和抑制腫瘤的過程中均扮演重要角色，因此腫瘤細胞中異常表達的lncRNAs可作為診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。Liu等[38]發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNAs CRNDE-h的水平與區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，用于診斷CRC的性能優(yōu)于CEA，同時還可作為預(yù)后判斷標(biāo)志物。另外,Dong等[39]通過篩選多類型標(biāo)志物后獲得的組合包括了2個mRNAs(KRTAP5-4和MAGEA3)與1個 lncRNAs(BCAR4)，可用于診斷CRC。值得一提的是在該研究中還對不同類型的細胞外囊泡中l(wèi)ncRNAs的類型進行比較，發(fā)現(xiàn)外泌體對于lncRNAs的富集作用要明顯優(yōu)于凋亡小體和微囊泡。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可調(diào)節(jié)親本基因的表達、選擇性剪切或轉(zhuǎn)錄過程，其還具備海綿的特性：在特定調(diào)節(jié)下吸收或者釋放miRNAs或RNAs。由于circRNAs的穩(wěn)定性，其對miRNAs的吸附能力要優(yōu)于mRNA與lncRNAs。circRNAs與miRNAs之間的密切聯(lián)系使得其被認為對于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有深遠的影響。在Dou等[40]所測定的3種CRC細胞系中，腫瘤細胞以及腫瘤細胞所分泌的細胞外微囊泡中均包含circRNAs，外泌體circRNAs類型與腫瘤細胞有較高的重復(fù)，但外泌體中circRNAs的水平要明顯高于腫瘤細胞。另外，其發(fā)現(xiàn)了KRAS突變的CRC細胞系中circRNAs的水平明顯下調(diào)的現(xiàn)象。鑒于有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)相比于健康人組織中的circRNAs，無論是CRC細胞系還是患者的腫瘤組織circRNAs的水平均全面下調(diào)[41]，因此circRNAs可能與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。

4 結(jié)語

CRC對人類健康生活的威脅與日俱增，闡明其發(fā)生和發(fā)展的機制將有助于為早期診斷、治療方式的選擇和預(yù)后評估等提供極大幫助。外泌體屬于腫瘤領(lǐng)域新興的研究靶標(biāo)，雖已有大量研究認可其在腫瘤微環(huán)境、啟動腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用，但涉及具體機制的報道仍是少數(shù)，更多僅局限于體外實驗所得到的表象結(jié)果。同時由于目前對于細胞外囊泡的分類方式仍舊不夠明確，之前報道的部分文獻結(jié)果并不能夠完全明確研究對象，即究竟是僅包括外泌體，還是混雜有其他類型的細胞外囊泡。但從上文羅列的一些研究數(shù)據(jù)來看，血清中的外泌體已具備輔助臨床診斷或預(yù)后判斷的應(yīng)用價值。后續(xù)如可有效篩選檢測靶目標(biāo)(蛋白質(zhì)/miRNAs，單一或者多個組合)，規(guī)范化從抽提到檢測的步驟，未來外泌體在臨床檢驗中的應(yīng)用前景可期。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.03

上海市衛(wèi)生計生系統(tǒng)重要薄弱學(xué)科建設(shè)項目(2015ZB0201)。

鄔升超，1990年生，男，大學(xué)本科，研究方向為臨床分子診斷。

潘柏申，研究員，E-mail:pan.baishen@zs-hospital.sh.cn。

R735.3

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2017-05-18)