細胞內(nèi)外鈣在激動劑收縮結(jié)腸平滑肌中的作用

周 華，李 華，張 敏，張 晟，張 平，姜文濤

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部生理教研室，安徽 合肥 230601)

·實驗研究·

細胞內(nèi)外鈣在激動劑收縮結(jié)腸平滑肌中的作用

周 華，李 華，張 敏，張 晟，張 平，姜文濤

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)部生理教研室，安徽 合肥 230601)

目的探討結(jié)腸平滑肌收縮效應(yīng)與細胞內(nèi)外鈣離子的關(guān)系。方法觀察有鈣和無鈣環(huán)境中，結(jié)腸平滑肌的收縮效應(yīng)。同時用M受體阻斷劑阿托品阻斷受體作用，建立store-operated鈣通道，并研究其對結(jié)腸平滑肌收縮效應(yīng)的影響。結(jié)果（1）無論是有鈣液中還是無鈣液中激動劑均引起結(jié)腸平滑肌收縮，在有鈣液內(nèi)激動劑的作用更大；（2）神經(jīng)遞質(zhì)ACh誘導(dǎo)的結(jié)腸平滑肌收縮反應(yīng)中，有store-operated鈣通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流參與。結(jié)論激動劑誘導(dǎo)的結(jié)腸平滑肌收縮反應(yīng)中，細胞內(nèi)外鈣均有作用，而且胞內(nèi)鈣庫耗竭激活的store-operated鈣通道也參與了收縮反應(yīng)。

大鼠，結(jié)腸，鈣，store-operated鈣通道

鈣離子是細胞內(nèi)重要的第二信使，它參與調(diào)節(jié)機體多種生命活動過程，如：神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮等。眾所周知，胞漿內(nèi)Ca2+濃度的變化是啟動平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)的核心[1]，而胞漿內(nèi)Ca2+主要來源于兩個方面：細胞內(nèi)鈣的釋放和細

胞外鈣的進入。在血管平滑肌上研究鈣信號用以對抗高血壓已得到廣泛開展，但對消化道平滑肌的研究相對較少。眾所周知，消化系統(tǒng)的消化功能與消化道的運動關(guān)系密切，消化道的運動即依賴消化道平滑肌的收縮，而Ca2+是觸發(fā)消化道平滑肌肌絲滑行的關(guān)鍵性因素。而胞內(nèi)Ca2+的來源無非是細胞內(nèi)鈣的釋放及細胞外鈣的進入。目前推測，消化系統(tǒng)炎癥疾病的病理性變化可能與細胞內(nèi)Ca2+信號紊亂有關(guān)，最終引起消化道平滑肌收縮性降低。本研究旨在討論細胞內(nèi)外鈣與激動劑引起的大鼠結(jié)腸平滑肌收縮之間的關(guān)系，并對其作用機制進行了分析，以期為臨床治療提供新的依據(jù)，為新型藥物的開發(fā)提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑

SD大鼠（安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）；乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）、阿托品（atropine）、維拉帕米（verapamil）、EGTA、DMSO均購自美國Sigma公司。Krebs液組成如下（mmol/L）：NaCl 114.0，KCl 4.7，MgCl21.2，CaCl22.5 NaH2PO41.8，Glucose 11.5，NaHCO318.0，pH 7.4±0.5；無鈣Krebs液為正常Krebs液去除CaCl2，其它成分不變。

1.1.2 儀器

JZ-100肌肉張力換能器、HSS-1數(shù)字式超級恒溫浴槽（成都儀器廠），Powerlab生物信號采集處理系統(tǒng)（Australia AD Instruments）。

1.2 實驗方法

1.2.1 張力測定

健康SD大鼠，150～250 g，雌雄不拘。實驗前禁食18 h，頸椎脫臼處死，迅速從直腸上方4 cm處取出結(jié)腸腸段（約2 cm），置于Krebs液中。用組織剪剪去周圍組織，清除腸內(nèi)容物，并去除腸管內(nèi)皮層。將標本置37℃Krebs液浴槽內(nèi)，通O2，調(diào)靜息張力為1 g。張力大小通過張力換能器輸入Powerlab數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)進行記錄。標本均在浴槽內(nèi)平衡1 h后開始實驗。所示的藥物濃度均為投入浴槽液中的終濃度。

1.2.2 實驗分組

激動劑-經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)ACh對離體大鼠結(jié)腸腸段收縮效應(yīng)觀察分為三組：ACh組（對照組），細胞外液無鈣組，細胞外鈣恢復(fù)組。ACh組：即向置于有鈣Krebs液的結(jié)腸腸段，投入ACh 5μmol/L；細胞外液無鈣組：待ACh誘導(dǎo)的結(jié)腸收縮反應(yīng)穩(wěn)定后，分別用無鈣Krebs液沖洗腸管（0Ca組）或向浴槽中加入EGTA（+EGTA組）以去除細胞外液中的鈣；細胞外鈣恢復(fù)組：即再次向細胞外液中恢復(fù)Ca2+2.5 mmol/L。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用配對t檢驗，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞外鈣對激動劑誘導(dǎo)的結(jié)腸平滑肌收縮的必要性

與對照組相比，0Ca組和+EGTA組，ACh誘導(dǎo)的結(jié)腸收縮反應(yīng)明顯降低，恢復(fù)胞外Ca2+后，張力大小又逐漸恢復(fù)（n=12，P＜0.001）。0Ca組中，張力（g）大小分別為：1.48±0.78，0.62±0.15，0.94±0.27；+EGTA組中，張力（g）大小分別為：1.44±0.40，0.72±0.18，1.54±0.26。

2.2 store-operated鈣通道與結(jié)腸平滑肌收縮

向無鈣Krebs液中的標本加入ACh 5 μmol/L，結(jié)腸迅速短暫收縮，該收縮依賴細胞內(nèi)貯存鈣的釋放，收縮反應(yīng)穩(wěn)定后，再加入M受體阻斷劑atropine10 μmol/L（阻斷受體的作用），在此基礎(chǔ)上恢復(fù)細胞外 Ca2+至2.5 mmol/L，結(jié)腸出現(xiàn)持續(xù)性收縮，該收縮依賴store-operated鈣通道介導(dǎo)的胞外鈣內(nèi)流。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，細胞內(nèi)鈣介導(dǎo)的收縮張力約（1.70±0.15）g，store-operated鈣通道介導(dǎo)的胞外鈣內(nèi)流引起的收縮張力約（0.83±0.45）g，內(nèi)鈣釋放介導(dǎo)的收縮張力約是胞外鈣內(nèi)流介導(dǎo)的收縮張力的2.1倍。

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因未明的結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，病程漫長，常反復(fù)發(fā)作，給人類的生活帶來極大的困擾。臨床研究表現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎的病人，排便習(xí)慣發(fā)生改變，常見腹瀉。經(jīng)證實，患者炎癥部位的平滑肌動力下降，使得結(jié)腸中食糜進行性往返運動的節(jié)段減少，加重腹瀉。而Ca2+在平滑肌運動中起重要作用，細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)是維持其正常收縮和舒張的基礎(chǔ)，鈣穩(wěn)態(tài)失衡可導(dǎo)致平滑肌收縮性改變，是許多疾病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。本實驗觀察了有Ca2+和無Ca2+條件下ACh對大鼠離體結(jié)腸平滑肌的收縮效應(yīng)，以觀察神經(jīng)遞質(zhì)對結(jié)腸平滑肌收縮的機制，為臨床治療提供新的依據(jù)。

目前，對于store-operated鈣通道的激活又有了新的認識，可能與STM1和Orai1兩種蛋白有關(guān)。STM1位于SR/ER膜上，可以探測SR/ER內(nèi)貯存的Ca2+的濃度，當貯存的Ca2+減少或耗竭時，STM1涌向ER/SR連合處，在那里它們直接與Orai1蛋白相互作用，并發(fā)送信號至Orai1蛋白，隨后通道打開介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流。因此，STM1和Orai1兩種蛋白被認為是組成store-operated鈣通道的最基本的功能單位。至于STM1和Orai1兩種蛋白是否會導(dǎo)致大鼠結(jié)腸平滑肌鈣穩(wěn)態(tài)失衡而引起動力紊亂，尚需進一步探討。

[1] David C. Hill-Eubanks1, Matthias E. Werner2, et al.Calcium Signaling in Smooth Muscle[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2011,3(a004549):1-20.

本文編輯：王雨辰

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ISSN.2095-8242.2017.08.1398.02

2013年高校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目：結(jié)腸SOC通道分子實質(zhì)及該通道對腸道炎癥調(diào)控研究（2013SQRL118ZD）