劉洪波, 陳修報, 蘇彥平, 姜濤, 楊健

中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國水產科學研究院長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價與資源養(yǎng)護重點實驗室，無錫 214081

銅是生物體必需元素之一，大量存在于陸地和水生態(tài)系統(tǒng)中。銅在淡水中的背景水平一般低于5 μg·L-1，超過一定濃度后就會產生生物毒性。然而起源于人類活動的銅卻仍在不斷地進入自然生態(tài)系統(tǒng)，進而導致污染甚至環(huán)境問題。比如硫酸銅經(jīng)常在控制藻類、細菌和真菌的生長方面被過度使用[1]。由于水環(huán)境的銅污染，加拿大某些區(qū)域飲用水的銅濃度高至750 μg·L-1[2]。我國亦常利用硫酸銅清塘滅藻，導致一些養(yǎng)殖池塘水的銅濃度可高達2 000 μg·L-1[3]。因此，對水生生物而言，銅目前已被列入需要高度關注的重金屬污染物[4]。

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，銅的生物毒性取決于自由離子活度，自由金屬離子的活度和環(huán)境水化學性質如DOC、pH、Ca2+、Mg2+、CO32-等的絡合和競爭有關。傳統(tǒng)的金屬基準值推導通常不考慮pH、DOC等的影響，僅用金屬總量來評估重金屬污染物的毒性。但歐洲[5]和美國[6]的研究表明，金屬總量中只有很小一部分是“生物可利用”并對有機體產生潛在毒性的，因此用金屬總量不能準確評估重金屬污染物實際的生態(tài)風險，對水環(huán)境來說有可能是過保護。鑒于此，歐美等國在制定本地的水、沉積物或土壤環(huán)境質量標準(基準)時，都普遍采用模型或其他驗證工具，如自由離子活度模型(free-ion activity models，F(xiàn)IAM)、生物配體模型(biotic ligand model，BLM)[7]或用梯度擴散薄膜(DGT)法原位測量水體中重金屬并計算金屬解離動力學及有效態(tài)組分[8]等，以便能夠更準確地預測銅及其他重金屬的生物可利用性。

美國淡水銅BLM模型數(shù)據(jù)輸入最低需要pH、硬度(主要指Ca2+和Mg2+)、DOC等指標，其中DOC是影響不同形態(tài)金屬尤其是自由金屬離子濃度的最重要因素[9-10]，已取代硬度被美國環(huán)保署作為制定關于重金屬元素國家水質標準首要考慮的水化學因子[11-12]。對不同環(huán)境下DOC與自由金屬離子相互作用的研究是現(xiàn)代毒理學研究的一個新熱點，其意義在于能更加合理地預測環(huán)境中重金屬的生物毒性。美國學者利用對銅較為敏感的淡水溝貝(fatmucket, Lampsilis siliquoidea)的稚蚌開展實驗，已證實DOC與水體銅形成有機絡合物可以消減銅的毒性[11]。然而，據(jù)筆者所知國內針對淡水貝類尚缺乏相關研究。

淡水貝類作為獨特的指示生物，曾被廣泛用于重金屬污染的監(jiān)測和環(huán)境中重金屬的生物有效性的預測中，特別是其生長的稚蚌階段，對環(huán)境中重金屬的變化尤其敏感[13]。然而，淡水貝類亦是世界上最瀕危的動物類群之一。如在美國的813種淡水貝類中就有約400種被列入2002國際自然保護聯(lián)盟紅皮書[14]。分析原因發(fā)現(xiàn)流域的生態(tài)和水質退化對于淡水貝類的影響最為關鍵。Cataldo等[15]研究了阿根廷三角洲地區(qū)河蜆(Corbicula fluminea)種群發(fā)現(xiàn)，在水體污染較重的地區(qū)水體污染導致的幼體高死亡率對于淡水貝類種群數(shù)目的影響最大。這充分證明了淡水貝類幼體階段在整個生活史階段是最脆弱的，為此進行早期生活史蚌與水質條件關系的研究，對于淡水貝類種群保護既具深刻的意義，又非常必要。

廣布于世界各地的背角無齒蚌屬典型的珠蚌類。其生長具有非常復雜的生活史，需經(jīng)歷配子的發(fā)生、胚胎發(fā)育、寄生、稚蚌、幼蚌以及成蚌的生長等多個發(fā)育階段[16]。2003年以來，背角無齒蚌被我們研究室做為“淡水貝類觀察”的特殊指示生物加以研究。目前在掌握其生活史狀況的基礎上，我們建立了“標準化”背角無齒蚌從鉤介幼蟲、稚蚌以及成蚌等全生活史各階段的實驗動物種群，并可利用該種群的各階段個體，對其進行相關重金屬毒性的敏感性和耐受情況等毒理學的深入研究[17]。

迄今，Cu已成為水生態(tài)系統(tǒng)最受關注的一種重金屬[4]。其也是我國漁業(yè)水域主要污染物之一[18]，并被列入了國家重點防控對象的名單中。由于貝類稚蚌階段個體自身的環(huán)境脆弱性，故基于其來研究生境中重金屬及其絡合情況對生物毒性的影響將更具研究價值。本研究擬利用自主繁育的背角無齒蚌稚蚌來評價Cu對其的急性毒性以及不同DOC濃度對相關毒性可能的影響，以期為進一步深入探討環(huán)境水化學因子的作用以及保護淡水貝類幼體資源等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

參照美國ASTM E2455-06 “Standard Guide for Conducting Laboratory Toxicity Tests with Freshwater Mussels”[19]和Wang等[20]的研究方法，本研究對實驗方法加以改進和完善。

1.1 實驗溶液

所有實驗用水采用在去離子水里添加人工海水鹽的方式配制，水中鹽度的終濃度為0.1‰；分析純CuCl2·2H2O購自上海國藥集團，所配母液濃度是5 mg·L-1; 在計算重金屬和DOC反應時通常假設DOC由一定比例的腐殖酸(FA)或僅由FA組成[9]，實驗用腐殖酸鈉鹽購自Sigma-Aldrich公司，碳含量為39%，原液濃度16 mg·L-1，折算成DOC名義濃度為6 mg C·L-1。原液用攪拌器攪拌至少12 h后方能添加Cu。

圖1 背角無齒蚌稚蚌注：A，活體；B，非活體。Fig. 1 Newly-transformed juveniles of Anodonta woodianaNote: A, alive individual; B, nonviable individual.

1.2 實驗材料

將直接取自中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉實驗基地人工繁養(yǎng)獲得的3只母蚌的成熟鉤介幼蟲放入盛有曝氣自來水的塑料盆中，并用玻璃棒攪拌均勻，然后將寄生魚黃顙魚放入盆中。20 min后，將黃顙魚取出，放入已準備好的盛有曝氣自來水的塑料水槽中暫養(yǎng)。根據(jù)背角無齒蚌鉤介幼蟲寄生發(fā)育的生物學零度和有效積溫，取脫落高峰期當天的稚蚌于實驗條件下暫養(yǎng)>24 h，在此期間，用含有0.01%濃度鹽水的標準試驗用水更換3次養(yǎng)殖水，每次的更換量為50%，之后選取活體稚蚌(日齡1～2 d)用于毒性實驗。在5 min之內，斧足伸出運動的稚蚌定義為活蚌 (圖1A)，反之，則認為是死亡個體(圖1B)。

1.3 急性毒性實驗

在采用國家標準GB/T 27861—2011所述的半靜態(tài)試驗方式并48 h換水條件下[21]，96 h銅和添加不同濃度DOC對銅急性毒性影響的實驗在防酸材質的塑料培養(yǎng)皿中進行，每個培養(yǎng)皿有5個蚌，內有100 mL暴露溶液，每個濃度組有3個平行，培養(yǎng)皿放在25 ℃、亮暗比為16 h:8 h、光強為200 lux冷光源的恒溫培養(yǎng)箱中，48 h換水時檢查對照組成活，96 h結束時檢查所有蚌的存活。Cu暴露的濃度梯度為0、10、23、45、90和180 μg·L-1，添加腐殖酸鈉鹽的濃度梯度為2、4、8、16 mg·L-1，折合成DOC濃度梯度為0.8、1.5、3.0和6.0 mg C·L-1。

1.4 水質指標的測定

實驗開始前取配好的50 mL各濃度組實驗用水，用于金屬陽離子、DOC、pH等水化學指標的測定。金屬陽離子用電感耦合等離子質譜儀(Agilent 7500ce ICP-MS, Agilent, USA)測定，利用元素標準添加回收法確認了測定精度，得到各元素的回收率均在97%～102%范圍內。DOC用總有機碳分析儀(TOC-VCPN,島津,日本)測定。pH用美國EUTECH的pH 510臺式酸度計測定。

實際測得的Cu濃度梯度為4.3、10.9、19.5、47.5、91.1和177.2 μg·L-1；DOC濃度梯度為0.3、1.5、1.9、3.1和5.3 mg C·L-1，0.8 和1.5 mg C·L-1組所測濃度比名義濃度明顯偏大(>20%)，可能是過濾不充分造成的。其余所測濃度與名義濃度的偏差均小于20%。我們僅對名義濃度的Cu和DOC值(除對照組用實測值0.3 mg C·L-1外)進行分析和討論。pH值的范圍為6.7～7.2。各水化學指標的測量結果見表1。

1.5 統(tǒng)計分析

運用SPSS 16.0中的probit模型對所得數(shù)據(jù)進行處理，計算出96 h半數(shù)效應濃度EC50(median effective concentration) 和95%置信區(qū)間值。用SPSS 16.0中的線性回歸分析來描述EC50值和DOC添加濃度之間的關系。

圖2 背角無齒蚌稚蚌在不同銅暴露濃度時添加0.3, 0.8, 1.5, 3和6 mg C·L-1濃度DOC后的存活率(96 h)Fig. 2 Survival percent of newly-transformed juveniles (96 h) of Anodonta woodiana in Cu treatments with varying DOC concentrations of 0, 0.8, 1.5, 3, and 6 mg C·L-1

圖3 背角無齒蚌稚蚌96 h Cu EC50值與不同DOC濃度間的線性相關性Fig. 3 A linear relationship between the Cu 96 h EC50s of juvenile Anodonta woodiana and DOC concentrations

濃度組Treatment溶解性有機碳/(mg·L-1)DOC/(mg·L-1)pH硬度/(mgCaCO3·L-1)Hardness/(mgCaCO3·L-1)96hEC50(95%CI)/(μgCu·L-1)0DOC0.36.78.319(13～27)0.8DOC1.56.86.923(17～31)1.5DOC1.96.836.417(12～23)3.0DOC36.978.513(8～19)6.0DOC5.37.2156.610(5～14)

2 結果(Results)

DOC對Cu急性毒性的影響反應在稚蚌的存活率上見圖2，隨著Cu濃度的升高，未添加DOC及各DOC添加組的稚蚌均反應出明顯的濃度-劑量效應，即Cu濃度越高，死亡率越大，并在10 μg·L-1Cu濃度時即有死亡的蚌出現(xiàn)。

對應0.3、0.8、1.5、3.0 和6.0 mg C·L-1DOC濃度組96 h Cu EC50值分別為19 (13～27)，23 (17～31)，17 (12～23)，13 (8～19) 和10 (5～14) μg·L-1(表1)，調整DOC濃度與稚蚌的96 h Cu EC50值呈負相關關系(R = -0.968, P=0.007, 圖3)。

3 討論(Discussion)

稚蚌96 h Cu EC50值為19 μg·L-1，低于美國環(huán)境保護署報道的淡水貝類Actinonaias sp. 和Utterbackia imbecillis稚蚌的Cu LC50或EC50值(27～199 μg·L-1)[6]，亦低于Wang等[20]研究所報道的稚蚌Neosho mucket (23～43 μg·L-1)，Scaleshell (29 μg·L-1，瀕危種)和Wavy-rayed lampmussel (21～25 μg·L-1)的EC50值，并且十分接近于漁業(yè)水質標準GB11607—89中有關Cu的限量標準(10 μg·L-1)。一方面，說明背角無齒蚌稚蚌對環(huán)境中Cu濃度的變化十分敏感，可以作為瀕危蚌種的替代指示物，用以較為有效地監(jiān)測水環(huán)境中銅污染的狀況；另一方面，在類似本研究中硬度和pH值低于前人報道的水環(huán)境里，稚蚌對重金屬離子濃度的變化可能更加敏感，更易引起活動減少甚至死亡的應激反應。Wang等[20]的研究實驗用水的硬度為177 mg·L-1，而本實驗對照組Ca2+([Ca]) 和 Mg2+([Mg]) 的濃度分別為1 和 1.4 mg·L-1，其實驗用水的硬度僅為8.3 mg·L-1(用CaCO3計算硬度，所用公式為2.47[Ca] + 4.11[Mg])[22]；此外，Wang等[20]實驗用水的pH為8.5，亦高于本實驗用水(pH=6.7～7.2)，二者水的硬度和pH的差異也許是導致背角無齒蚌稚蚌對銅較為敏感的重要原因。具體的機制尚待今后進一步的研究來確定。

金屬自由陽離子主要隨DOC濃度的變化而變化，對毒性金屬而言，通常認為DOC是影響其生物利用度最重要的水化學因子，因為DOC可與銅絡合成不具有毒性的溶解性銅Cu-DOC[11-12]，可以有效緩解Cu的毒性；因此，美國環(huán)保署將其作為制定關于重金屬元素新的國家水質標準首要考慮的水化學因子。值得注意的是，從本研究的結果來看，僅調整DOC濃度，而不調整硬度和pH，對降低銅毒性、減少稚蚌的死亡以及提高96-h Cu EC50值等方面效果并不明顯，甚至有負相關關系(R= -0.968, P=0.007)。

在以往對鎘毒性的研究中也出現(xiàn)過類似情況，如有研究發(fā)現(xiàn)有機配體(蘋果酸、檸檬酸)的存在對小麥根的Cd毒性影響不大[7]，推測植物對Cd的吸收是受溶液相中擴散過程控制，有機配體的加入可以幫助Cd2+從溶液中運輸?shù)缴锬け砻?，促進植物根系吸收，造成毒性不變或增加。但背角無齒蚌稚蚌對Cu的吸收是否與植物類似，需要進行更多的研究來加以證實。

我們曾經(jīng)研究了調節(jié)暴露溶液硬度(CaCO3)即鈣(Ca)或鎂(Mg)離子的濃度后對降低銅毒性的影響，發(fā)現(xiàn)雖然Ca離子在某個特定的濃度下對降低銅毒性有作用，但與Ca濃度組之間不呈線性相關[23]，這與本研究的結果相似。在0.8 mg C·L-1DOC濃度調節(jié)下，盡管銅毒性有暫時性的降低，但在更高濃度的DOC溶液中，稚蚌的死亡并沒有隨之有效降低；顯示競爭和絡合在降低重金屬毒性機理上的復雜性。

在與陰離子的絡合作用中，銅可與生物體內調節(jié)鈉(Na)和氯(Cl)離子的特定酶相互作用, 與生物體(主要指腮)表面某些特定的活性位點(如氯細胞)結合，使鈉離子吸收受阻，破壞生物體的離子平衡，導致生物體死亡[9]；同時由于水溶性銅的形態(tài)還有CuCO3、Cu(OH)+等形式，pH值的高低有可能影響上述結合形態(tài)的存在狀況；同時，DOC作為金屬配體的形式也是多樣的，甚至一些有機絡合形態(tài)[24]也可以被生物直接吸收而產生毒性。此外，金屬硫蛋白也有可能對腮、消化腺中Cu等的儲存、運輸和代謝產生影響[25]；因此僅靠調整DOC達到減弱金屬毒性的目的是很難實現(xiàn)的[11]。在下一步研究中要考慮取用富含DOC、硬度適中及pH偏堿的天然水作為實驗用水，以驗證最佳的水化學指標組合對減輕重金屬毒性的有效性。

致謝：感謝中國科學院南京地理與湖泊研究所李寬意研究員和黃建明工程師在DOC分析中給予的幫助。

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