苑 博

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070）

淺談3R原則及其在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用

苑 博

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070）

3R原則(即替代,減少,優(yōu)化)廣泛適用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)和任何科研領(lǐng)域的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。成功應(yīng)用3R的關(guān)鍵是在收集數(shù)據(jù)之前,需要提前考慮好合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法。很多實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則,比如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要有效、可靠和高效;實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)方法要清晰透明;在實(shí)驗(yàn)室確保對(duì)動(dòng)物福利的尊重和理解,都是有助于實(shí)現(xiàn)3R原則目標(biāo)的關(guān)鍵。

3R原則;實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì);應(yīng)用

1 3R原則

3R原則是1959年英國(guó)動(dòng)物學(xué)家William Russell和微生物學(xué)家Rex Burch在經(jīng)典著作《仁慈試驗(yàn)技術(shù)原理》提出的[2]。3R原則中的“R”分別是replacement（替代），reduction（減少），refinement（優(yōu)化）。作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理法則，應(yīng)用于任何與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)的科學(xué)研究、實(shí)驗(yàn)教學(xué)及其他領(lǐng)域中。旨在倡導(dǎo)研究者在工作中用其他實(shí)驗(yàn)方法或?qū)嶒?yàn)材料取代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量降到最低，改善或者降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物承受的痛苦。

第一個(gè)“R”，replacement（替代），分為絕對(duì)替代和相對(duì)替代。絕對(duì)替代是最理想的結(jié)果，比如通過(guò)計(jì)算機(jī)建立虛擬模型來(lái)替代活體動(dòng)物和動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞、組織、器官，完全取代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而相對(duì)替代，則是指使用動(dòng)物來(lái)源的，已經(jīng)建立好的細(xì)胞系，或者用低疼痛感的模式動(dòng)物（單細(xì)胞動(dòng)物）替代哺乳動(dòng)物。

第二個(gè)“R”，reduction（減少），指在不影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的“質(zhì)”和“量”的前提下，盡可能減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的利用率和實(shí)驗(yàn)的精確度。“減少”不單是指在原有的實(shí)驗(yàn)上減少使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，除此之外，還有一層“相反”的含義，就是增加單個(gè)小實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物使用量，所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以有效減少整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需的動(dòng)物數(shù)總量。

最后，第三個(gè)“R”，refinement（優(yōu)化），指通過(guò)任何途徑來(lái)避免或減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物現(xiàn)有的或潛在的精神緊張、痛苦和不良反應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。Russell和Burch把對(duì)動(dòng)物的傷害分為必然傷害和偶然傷害。必然傷害是指實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)帶給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害，偶然傷害則是由于操作不當(dāng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的意外傷害。

2 3R在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用

無(wú)論是教學(xué)還是科研，3R原則在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)部分的應(yīng)用至關(guān)重要，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析方法從根本上決定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的“最少”使用量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物承受的“最低”痛苦?！白钌佟焙汀白畹汀笔侵冈诶硐霠顟B(tài)下，沒(méi)有因?qū)嶒?yàn)操作不當(dāng)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物意外的死亡和不必要的傷害。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的，通常是驗(yàn)證假設(shè)，一般我們可以通過(guò)檢測(cè)某個(gè)特異性指標(biāo)來(lái)驗(yàn)證假設(shè)。無(wú)論是通過(guò)何種方法驗(yàn)證假設(shè)，3R原則都應(yīng)該始終貫穿其中，即與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析緊密相連，盡量用模式動(dòng)物替代哺乳動(dòng)物，或者在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，用模擬實(shí)驗(yàn)替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；減少對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果價(jià)值很少甚至沒(méi)有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，避免不必要的浪費(fèi)；優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，以避免或減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛苦，精神緊張和傷害的時(shí)間，以改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利[3]。如何在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下，遵循3R原則，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段，把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用量降到最低，把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物承受的痛苦降到最低，是每一個(gè)研究者在設(shè)計(jì)研究方案期間必須思考的問(wèn)題。

2.1 減少實(shí)驗(yàn)中所需要的動(dòng)物數(shù)量

2.1.1 判斷適當(dāng)?shù)臉颖敬笮?/p>

理想情況下，如果不考慮倫理，資金，時(shí)間，人力物力或其他方面的成本，研究人員希望通過(guò)檢測(cè)全部目標(biāo)人群來(lái)揭示事物的本質(zhì)或者真理。顯然，在絕大多數(shù)情況下，這既不可能也不可取，因此，研究人員必須在保證研究結(jié)論具有一定可靠性的前提下，估算最少的樣本量。不能少于“必要的數(shù)量”，也不能過(guò)多。這個(gè)數(shù)字無(wú)論過(guò)多還是過(guò)少，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都是不負(fù)責(zé)的表現(xiàn)。

從實(shí)際情況上看，國(guó)內(nèi)建筑業(yè)的迅速發(fā)展主要是依賴經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步，人們對(duì)建筑質(zhì)量有更高的要求，對(duì)建筑水平也提出了更多的要求，這些都是促進(jìn)建筑業(yè)整體發(fā)展的重要因素。而國(guó)內(nèi)建筑業(yè)取得了不錯(cuò)的成就，在技術(shù)以及管理上都是在不斷進(jìn)步的，安全管理是建筑建設(shè)中最關(guān)鍵的管理內(nèi)容，加強(qiáng)管理的力度可以讓人們更加相信建筑的可靠性。在施工中建筑安全監(jiān)督也是不可缺少的，這對(duì)保證現(xiàn)場(chǎng)的安全以及居民的安全都有非常深遠(yuǎn)的影響，對(duì)人們的生命健康以及財(cái)產(chǎn)安全都有直接的影響。因此在建筑建設(shè)中質(zhì)量安全的嚴(yán)格監(jiān)督是必不可少的[1]。

理論上，“必要的數(shù)量”（樣本量）取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)的變量類型（連續(xù)型變量，分類型變量等）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)、檢驗(yàn)功效、總體標(biāo)準(zhǔn)差、容許誤差都是決定樣本含量的要素。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法越復(fù)雜，精密度準(zhǔn)確度要求越高，需要估計(jì)的未知變量越多，樣本就越大，計(jì)算也越復(fù)雜。

2.1.2 采用高效的設(shè)計(jì)方案

為了增加實(shí)驗(yàn)的檢驗(yàn)功效，研究者可以增加樣本量，減少現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)的變異，采用替代措施，在解答相同研究假設(shè)的基礎(chǔ)上，獲得更大的（標(biāo)準(zhǔn)化）效應(yīng)量。比如應(yīng)用區(qū)組化設(shè)計(jì)消除個(gè)體變異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，或者在嵌套設(shè)計(jì)中，采用因素組合而不是一次測(cè)試一個(gè)因素，這樣可以從相同數(shù)量的動(dòng)物中收集更多信息，并且每個(gè)因素組合可以設(shè)計(jì)有相對(duì)較少數(shù)量的動(dòng)物。

2.2 使用其他手段替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)用絕對(duì)替代，必須保證獲得的數(shù)據(jù)與其所替代的基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所獲得的一樣可靠、有效。如果失去這個(gè)前提，特別是在醫(yī)學(xué)模型設(shè)計(jì)或者毒理學(xué)試驗(yàn)中，就變得沒(méi)有意義了。

關(guān)于相對(duì)替代，英國(guó)1986年制定的《動(dòng)物（科學(xué)方案）法令》（《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法》）對(duì)動(dòng)物物種以及物種的發(fā)育階段進(jìn)行分級(jí)，作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中相對(duì)替代的選擇原則。

替代方案合理性的評(píng)估指標(biāo)是相關(guān)性和可靠性。相關(guān)性相當(dāng)于預(yù)測(cè)效度，而可靠性是指實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。

2.3 優(yōu)化現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)，減少動(dòng)物受到的痛苦和傷害

Russell和Burch把“優(yōu)化”分為兩種，一種是針對(duì)由實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本身給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來(lái)的痛苦，一種是針對(duì)由于疏忽大意給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來(lái)的意外傷害。第一種一般是建立模擬人類某種疾病的動(dòng)物模型，這種情況，我們應(yīng)該盡可能在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，降低由疾病造成的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物痛苦的時(shí)間，減輕傷害的程度。比如，美國(guó)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定，荷瘤小鼠的腫瘤最大直徑不能超過(guò)2 cm，違反動(dòng)物倫理要求，再有貢獻(xiàn)的研究數(shù)據(jù)也會(huì)被撤銷，甚至研究結(jié)論也會(huì)遭到質(zhì)疑。2015年，一篇4年前發(fā)表于《Nature》的文章引起了爭(zhēng)議，原因就是研究人員使小鼠腫瘤體積超過(guò)了規(guī)定大小。最后文章雖然沒(méi)有被撤稿，但有關(guān)小鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)被撤銷。除此之外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在過(guò)程中的恐懼和痛苦，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行干擾，增加實(shí)驗(yàn)的變異性/偏差[4]。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，注重實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利，不僅是倫理要求，也是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種負(fù)責(zé)。

3 結(jié)語(yǔ)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)廣泛存在于基礎(chǔ)研究（教學(xué)），臨床藥物研究以及獸醫(yī)研究中。每年為此貢獻(xiàn)出生命的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量相當(dāng)龐大。一項(xiàng)科學(xué)研究，想要得出客觀理性的結(jié)論，必須有扎實(shí)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)做保證，設(shè)計(jì)不佳的實(shí)驗(yàn)和不充分的統(tǒng)計(jì)分析，會(huì)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不必要的損失，違背實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的3R原則。

想要在實(shí)驗(yàn)中成功應(yīng)用3R原則，關(guān)鍵在于收集數(shù)據(jù)前反復(fù)思考的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)方法。而3R原則的應(yīng)用也可以起到改進(jìn)實(shí)驗(yàn)研究的目的。比如，合理、可靠、高效的實(shí)驗(yàn)方案；清晰、明確的觀察指標(biāo)；實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的重視。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用減到最少，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害降到最低，是我們一直需要努力的方向。

[1] Peter Singer.動(dòng)物研究中的倫理學(xué)問(wèn)題[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，2004，17（2）：31-34，36．

[2] Russell WMS，Burch RL．The Principles of Humane Experimental Technique[M]. London：Methuen，1959．

[3] 白晶.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則的倫理論證[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，2007，20（5）：48-50．

[4] 楊青.國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利現(xiàn)狀與思考[J].天津醫(yī)學(xué)，2011，23（4）：74-76．

Introduction to 3R Principle and the Application in Experimental Design

Yuan Bo
(Basic Medical College of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)

The 3R principle(replacement,reduction,and refinement)could be apply to experimental teaching and animal experiments in any study. The key to the successful application of the 3R principle is the need to prioritize reasonable experimental design and analysis methods before collecting data. Indeed,many design principles are the key to achieving the 3R principle goal,such as design valid,reliable and efficient experiments;report the findings clearly and transparently;ensure that the respect and understanding of animal welfare play a central role in the laboratory.

3R principle;experimental design;application

天津醫(yī)科大學(xué)教學(xué)研究基金。

苑博,碩士,助理實(shí)驗(yàn)師,研究方向:機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理。