李在建+易維學(xué)+操繼躍

摘要：測(cè)定了糞腸球菌（Enterococcus Faecalis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）對(duì)致病性大腸桿菌O54、霍亂沙門(mén)氏菌A72及正常菌嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌均可較好的抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)；糞腸球菌對(duì)嗜酸乳酸桿菌起到較好的促生長(zhǎng)作用；枯草芽孢桿菌與嗜酸乳酸桿菌混合培養(yǎng)的前35 h，對(duì)嗜酸乳酸桿菌有一定的抑制作用，但35 h以后則對(duì)其有較好的促生長(zhǎng)作用。

關(guān)鍵詞：糞腸球菌；枯草芽孢桿菌；混合培養(yǎng)；體外評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6200-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.050

Abstract：The effect of E. faecalis， B. subtilis on the growth of Escherichia coli O54（E. coli）， Salmonella choleraesuis A72 （S. choleraesuis） and normal bacterial Lactobacillus acidophilus were studied in this research. The results showed that the growth of E. Coli and S. choleraesuis could be well inhibited by E. faecalis and B. subtilis. E. faecalis could promote the growth of L. acidophilus. However， L. acidophilus could be inhibited by B. subtilis in the pre-35h of mixed culture， and then， they could be promoted growth well.

Key words：E. faecalis； B. subtilis； mixed culture； vitro evaluation

益生菌制劑又名促生素，活菌制劑，益生素。益生素由美國(guó)學(xué)者Parker于1974首次提出，是與抗生素相對(duì)應(yīng)的新概念，用來(lái)表示給動(dòng)物飼用的微生態(tài)制劑，它可以直接飼喂動(dòng)物并通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡達(dá)到預(yù)防和治療疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)以及提高飼料報(bào)酬的活性微生物，從而調(diào)整體內(nèi)微生態(tài)平衡[1，2]，有的益生菌制劑還含益生菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[3]。某些益生菌不但可以提高飼料轉(zhuǎn)化率和畜禽的生產(chǎn)性能，而且對(duì)改善動(dòng)物健康狀況，降低畜禽產(chǎn)品中膽固醇的含量有著很好的作用。此外，微生態(tài)制劑可顯著減少畜牧生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)環(huán)境造成的污染[4]。

乳酸菌和芽孢桿菌能產(chǎn)生多種細(xì)菌素，其中大部分能夠抑制或殺滅革蘭氏陽(yáng)性菌，另外的極少數(shù)則對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌有較好抑制或殺死作用。因此，當(dāng)治療革蘭氏陰性菌導(dǎo)致的疾病時(shí)，篩選能夠抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的益生菌具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)通過(guò)益生菌和致病菌及有益菌的聯(lián)合培養(yǎng)，建立細(xì)菌聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線，探討糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對(duì)致病性細(xì)菌大腸桿菌O54、霍亂沙門(mén)氏菌A72以及腸道正常菌嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長(zhǎng)繁殖的影響，在體外確證這兩種菌在臨床應(yīng)用上的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品

胰蛋白胨和酵母提取物為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品；TSA和M-H肉湯為英國(guó)BD公司產(chǎn)品；葡萄糖購(gòu)自廣東光華化學(xué)廠有限公司（批號(hào)：20070528）；氯化鈉（分析純，批號(hào)：F20070726），二甲亞砜（分析純，批號(hào)：T20080229），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SS瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20090317-01），伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）培養(yǎng)基（批號(hào)：20090203-02），均由杭州微生物試劑有限公司提供；乳桿菌選擇性培養(yǎng)基（LBS，批號(hào)：090504），由上海盛思生化科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌與糞腸球菌，由滄州興業(yè)生物技術(shù)有限公司提供；大腸桿菌O54，霍亂沙門(mén)氏菌A72由武漢工業(yè)學(xué)院飼料科學(xué)系提供；嗜酸乳酸桿菌CICC6075，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC29213由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法

本試驗(yàn)采用較為常用的平板活菌計(jì)數(shù)法，其原理是將待測(cè)菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋，涂布在相應(yīng)的無(wú)菌瓊脂平板上，置于適宜的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后在平板上形成肉眼可見(jiàn)的菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計(jì)算出原始菌液濃度[5]。

1.4 糞腸球菌和枯草芽孢桿菌繁殖速率的測(cè)定方法

首先將復(fù)活的菌液1 mL接種到9 mL的滅菌TSB培養(yǎng)基中，混勻后立即開(kāi)始活菌計(jì)數(shù)，所測(cè)得的菌液濃度為X1，剩余的9 mL菌液置于37 ℃，180 r/min條件下水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，計(jì)時(shí)為T(mén)1，培養(yǎng)至?xí)r間T2后取出1 mL立即開(kāi)始活菌計(jì)數(shù)，所測(cè)得的菌液濃度為X2。由于細(xì)菌是以二等分分裂法繁殖的，因此細(xì)菌的濃度滿足關(guān)系式：X2=2nX1，則n=3.31（lgX2-lgX1），世代時(shí)間G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]。（G表示世代周期，n表示細(xì)菌繁殖的次數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌與枯草芽孢桿菌的世代時(shí)間測(cè)定結(jié)果

接種糞腸球菌時(shí)所測(cè)得菌懸液濃度X1為3.8×104，培養(yǎng)時(shí)間約為5 h，此時(shí)測(cè)得的菌懸液濃度X2為2.3×108。由公式G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]算得糞腸球菌的世代時(shí)間G=23.9 min。

接種枯草芽孢桿菌時(shí)所測(cè)得菌懸液濃度X1為7.2×104，培養(yǎng)時(shí)間約為6 h，此時(shí)測(cè)得的菌懸液濃度X2為3.5×108。由公式G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]算得枯草芽孢桿菌的世代時(shí)間G=29.4 min。

2.2 飼用益生菌對(duì)致病菌和腸道正常菌生長(zhǎng)繁殖的影響

2.2.1 糞腸球菌對(duì)大腸桿菌O54、霍亂沙門(mén)氏菌A72及嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長(zhǎng)繁殖的影響 由圖1可知，從第6 h開(kāi)始，混合培養(yǎng)體系里的大腸桿菌O54濃度要顯著低于其單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的濃度，糞腸球菌對(duì)大腸桿菌O54的拮抗作用在12～48 h達(dá)到頂峰，后面各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的菌懸液濃度也存在較大差異，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異極顯著（P<0.01）。由此可以推斷出，當(dāng)大腸桿菌O54和枯草芽孢桿菌在一個(gè)混合體系中共同存在時(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌O54的生長(zhǎng)繁殖具有較好的抑制作用，該株枯草芽孢桿菌具有較好的益生作用。

2.2.2 糞腸球菌對(duì)霍亂沙門(mén)氏菌A72生長(zhǎng)繁殖的影響 由圖2可知，從第6 h開(kāi)始，混合培養(yǎng)體系里霍亂沙門(mén)氏菌A72的菌懸液濃度要顯著低于其單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的濃度，60 h后其濃度呈急劇下降的趨勢(shì)，6到60 h的階段各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的數(shù)目也呈顯著差異。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌懸液濃度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異極顯著（P<0.01）。由此可以推斷出，當(dāng)霍亂沙門(mén)氏菌A72和糞腸球菌在一個(gè)混合培養(yǎng)體系中，在適宜條件下共同培養(yǎng)時(shí)，糞腸球菌對(duì)霍亂沙門(mén)氏菌A72的生長(zhǎng)具有較好的抑制作用，該株糞腸球菌具有很好的益生作用。

2.2.3 糞腸球菌對(duì)嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長(zhǎng)的影響 由圖3可知，除了第30 h，其他混和培養(yǎng)組的嗜酸乳酸桿菌CICC6075數(shù)目就顯著比單獨(dú)培養(yǎng)組的乳酸桿菌數(shù)目多，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌濃度差異極顯著（P<0.01），這表明，糞腸球菌對(duì)嗜酸乳酸桿菌CICC6075具有較好的促生長(zhǎng)作用。

2.2.4 枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌O54生長(zhǎng)繁殖影響的試驗(yàn)結(jié)果 由圖4可知，從第6 h開(kāi)始，混合培養(yǎng)體系里的大腸桿菌O54濃度要顯著低于其單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的濃度，后面各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的菌懸液濃度也有很大差別，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異極顯著（P<0.01）。由此可以看出，當(dāng)大腸桿菌O54和枯草芽孢桿菌在一個(gè)混合體系中共同培養(yǎng)時(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌O54具有較好的抑制作用，該株枯草芽孢桿菌具有優(yōu)良的益生作用。

2.4.5 枯草芽孢桿菌對(duì)霍亂沙門(mén)氏菌A72生長(zhǎng)繁殖影響的試驗(yàn)結(jié)果 由圖5可知，從第6 h開(kāi)始，混合培養(yǎng)體系里的霍亂沙門(mén)氏菌A72的濃度要顯著低于霍亂沙門(mén)氏菌A72單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的濃度，60 h后霍亂沙門(mén)氏菌A72的濃度呈急劇下降的趨勢(shì)，6～60 h的階段各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的菌懸液濃度較對(duì)照組也明顯偏低。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異極顯著（P<0.01）。由此可以看出，當(dāng)霍亂沙門(mén)氏菌A72和枯草芽孢桿菌在一個(gè)混合體系中，在適宜條件下共同培養(yǎng)時(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)霍亂沙門(mén)氏菌A72的生長(zhǎng)繁殖具有較好的抑制作用，證明該株枯草芽孢桿菌具有優(yōu)良的益生作用。

2.4.6 枯草芽孢桿菌對(duì)嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)結(jié)果 由圖6可知，在0～5 h階段，嗜酸乳酸桿菌CICC6075單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)菌懸液濃度非常接近，5～35 h這段時(shí)間內(nèi)，嗜酸乳酸桿菌CICC6075混合培養(yǎng)時(shí)的菌懸液濃度較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)小，且差異極顯著（P<0.01），但35 h以后混合培養(yǎng)的乳酸桿菌開(kāi)始迅速大量繁殖，數(shù)目迅速增多，到40 h左右菌懸液濃度已經(jīng)超過(guò)了單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的菌懸液濃度，由此可以推斷出在生長(zhǎng)后期枯草芽孢桿菌對(duì)嗜酸乳酸桿菌CICC6075具有較強(qiáng)的促生長(zhǎng)作用。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對(duì)致病性大腸桿菌O54和霍亂沙門(mén)氏菌A72有較強(qiáng)的拮抗作用，與對(duì)照組相比一般抑制率可達(dá)90%以上，對(duì)嗜酸乳酸桿菌CICC6075的生長(zhǎng)可起到促進(jìn)作用。該結(jié)果在動(dòng)物活體試驗(yàn)上也得到了驗(yàn)證，易中華[6]用枯草芽孢桿菌和寡聚糖配伍使用，結(jié)果表明，它們能顯著增加肉雞盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量，減少致病性大腸桿菌的數(shù)量；閆風(fēng)蘭等[7]通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種不同枯草芽孢桿菌均能增加肉雞腸道中乳酸桿菌的數(shù)量；張璐[8]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可顯著降低14、21日齡肉雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量。薛勝平等[9]研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌的抑制作用分別達(dá)到5 000倍、8倍。而王鋰韞等[10]從酸馬奶酒中分離出來(lái)的糞腸球菌對(duì)大腸桿菌幾乎沒(méi)有抑制作用。這可能是由于菌株的來(lái)源不同導(dǎo)致細(xì)菌的特性有一定差別。

糞腸球菌被認(rèn)為是一種條件致病菌，在人的免疫力低下或有嚴(yán)重通常導(dǎo)致尿路感染、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、傷口感染等疾病[11，12]，但在一般情況下對(duì)人體和動(dòng)物是沒(méi)有危害的的，屬于人和動(dòng)物體內(nèi)的常在菌?？莶菅挎邨U菌是一種較為安全的細(xì)菌，不會(huì)對(duì)人和動(dòng)物造成危害。本試驗(yàn)中，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對(duì)致病菌的抑制作用可能與它們強(qiáng)大的細(xì)菌素分泌功能有關(guān)，一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌E.faecalis RJ-Ⅱ、E.faecalis LMG可以產(chǎn)生如細(xì)菌素Enterocin RJ-Ⅱ和Enterolysin A之類的細(xì)菌素[13，14]，這些代謝性產(chǎn)物可能對(duì)致病性的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌有較好的抑制生長(zhǎng)作用?？莶菅挎邨U菌通常被認(rèn)為是一種非致病菌，可以產(chǎn)生如肽類的抗生素枯草菌素和伊枯草菌素之類的細(xì)菌素[15]，這些物質(zhì)可能對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌有較好的抑制作用。

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌O54、霍亂沙門(mén)氏菌A72生長(zhǎng)的抑制作用主要表現(xiàn)在混合培養(yǎng)6 h以后的階段，這說(shuō)明只有當(dāng)糞腸球菌和枯草芽孢桿菌達(dá)到較大的菌懸液濃度時(shí)且與大腸桿菌O54和霍亂沙門(mén)氏菌A72共存于同一培養(yǎng)體系時(shí)才具有較好的益生效果。

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