鄭威+張?jiān)倨?廖黎娟+劉金龍+戴光忠+楊軍

摘要：從煙草廢棄物中分離出一株能大量生產(chǎn)有機(jī)硒的微生物菌株。采用細(xì)菌分離篩選方法選育出單菌種，用無機(jī)硒配制發(fā)酵液，進(jìn)行有機(jī)硒轉(zhuǎn)化效果試驗(yàn)。用光學(xué)顯微鏡觀察菌種形態(tài)特征，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行一系列生理化學(xué)反應(yīng)觀察其生理生化特征。應(yīng)用基因測序技術(shù)，確定物種歸屬。結(jié)果表明，該菌為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）種的新菌株。該菌可將700 mg/L亞硒酸鈉全部轉(zhuǎn)化為水溶性有機(jī)硒，用于水稻根外噴施，水稻對(duì)該發(fā)酵液發(fā)酵生產(chǎn)的有機(jī)硒利用率最高達(dá)64.12%，稻米中總硒含量最高達(dá)0.432 mg/kg，有機(jī)硒占總硒的比例最高達(dá)84.9%。

關(guān)鍵詞：富有機(jī)硒菌；菌種鑒定；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）

中圖分類號(hào)：Q939.99 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）24-6389-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.018

硒是人體必需的微量元素之一，必須通過飲食獲取，硒廣泛分布于機(jī)體的各組織器官、體液中，在腎中濃度最高。硒在人體內(nèi)總量為14～20 mg，具有抗氧化作用（抗輻射、抗炎、抗衰老）、提高免疫功能（抗病毒）、抗癌、維持甲狀腺正常功能、促進(jìn)生殖作用、拮抗重金屬、抗糖尿病、抗高血壓、保護(hù)肝臟、參與蛋白質(zhì)和酶及輔酶的合成等功效，可預(yù)防克山病、大骨節(jié)病、心血管病、癌癥、糖尿病等40多種疾病[1-5]，與人體健康息息相關(guān)，。

由于硒不能在人體長期儲(chǔ)存，面對(duì)人體內(nèi)硒的不斷流失和攝入不足，機(jī)體必須不斷從飲食中獲得足量的硒，才能維持硒在身體內(nèi)的平衡。硒濃度的平衡對(duì)許多器官、組織的生理功能有著重要的保護(hù)和促進(jìn)作用。目前許多對(duì)疾病的化學(xué)干預(yù)試驗(yàn)已證明硒蛋白在一些重大疾病防治中具有重要作用[6]。

全世界有40多個(gè)國家和地區(qū)屬于缺硒地區(qū)。中國存在一條從東北三省斜穿至云貴高原的低硒帶，導(dǎo)致占國土面積72%的地區(qū)屬低硒地區(qū)，其中缺硒區(qū)占43%，嚴(yán)重缺硒地區(qū)占29%，糧食等天然食物硒含量較低，通過使用這些食物不能滿足人體對(duì)硒的需求[7]。中國近2/3的人缺硒或處于缺硒邊緣[8]。中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦硒的日攝入量不能低于60 μg，正常成人日攝入硒的安全和合適范圍為60～250 μg，且膳食硒日最高安全攝入量為400 μg[9-11]。

自然界中存在的硒元素分為無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種。無機(jī)硒一般指亞硒酸鈉和硒酸鈉等；有機(jī)硒是通過生物轉(zhuǎn)化使硒與生物體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)結(jié)合而成，一般以硒蛋白、硒氨基酸、硒多糖、硒核酸[12-14]等形式存在。二者都可以被動(dòng)物吸收利用，但與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒具有使用較安全、吸收利用率高、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)。微生物富硒發(fā)酵是利用生物資源對(duì)硒開發(fā)的一項(xiàng)重要課題，具有廣闊的前景。硒多糖、硒蛋白、硒核酸都是易于被動(dòng)植物吸收的優(yōu)良補(bǔ)硒劑，具有良好的藥理及保健作用。

目前有機(jī)硒的獲得包括微生物轉(zhuǎn)化法、植物轉(zhuǎn)化法和動(dòng)物轉(zhuǎn)化法等[15]，微生物轉(zhuǎn)化法中較多的是利用酵母[16]和乳酸菌[17]。在富硒區(qū)，僅僅依靠土壤中的硒很難使農(nóng)產(chǎn)品的硒含量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，必須依靠外源補(bǔ)硒，即通過生物轉(zhuǎn)化來獲得有機(jī)硒含量較高的農(nóng)產(chǎn)品，但目前生產(chǎn)上多用亞硒酸鈉根外噴施來獲得富硒農(nóng)產(chǎn)品，硒的利用率不高，且轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的效率不高，使富硒農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)硒的含量很低。因此，本研究致力于通過微生物提高有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而為提高農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)硒含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 智能發(fā)酵罐（鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州隆意達(dá)凈化科技有限公司）、恒溫?fù)u床（武漢科學(xué)儀器廠）、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、250和500 mL三角瓶、光學(xué)顯微鏡。

1.1.2 菌種 分離得到具有高無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒能力的Ⅲ號(hào)菌種。

1.1.3 培養(yǎng)基 葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂15～20 g、NaCl 5 g、去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；明膠培養(yǎng)基：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、明膠120 g，加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4；糖代謝檢測培養(yǎng)基：（NH4）2HPO4 1.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、酵母膏0.2 g、瓊脂15 g、溴甲酚紫0.008 g、葡萄糖5 g（可用核糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇代替），加去離子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離篩選 采樣與樣品處理：采集湖北恩施市白楊坪的富硒煙草廢棄物，稱取1 g樣品置于盛有99 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩。

分離：采用梯度稀釋分離法稀釋10-2～10-8倍，從10-6～10-8稀釋液中各取0.1 mL均勻涂抹于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察，挑取不同形態(tài)的單一菌落，轉(zhuǎn)接至葡萄糖牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，挑取分離到的菌落形態(tài)不同的5個(gè)菌株，并編號(hào)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，進(jìn)一步純化。

篩選：將進(jìn)一步純化得到的5個(gè)菌株進(jìn)行耐硒性檢測，在葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入Na2SeO3（以Se計(jì)，下同）300～700 mg/L進(jìn)行培養(yǎng)，其中Ⅲ號(hào)菌株長勢良好。

純化：將Ⅲ號(hào)菌株采用平板劃線法分離純化，涂葡萄糖牛肉膏蛋白胨平板檢驗(yàn)直至不出現(xiàn)雜菌為止。

1.2.2 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 在無菌環(huán)境中，挑取兩環(huán)Ⅲ號(hào)菌株的純化菌種于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，30 ℃ 150 r/min培養(yǎng)6～9 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 于10 L不銹鋼自控發(fā)酵罐中進(jìn)行，葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基裝料體積為發(fā)酵罐容積的70%，0.12 MPa滅菌25 min，待培養(yǎng)基溫度下降至35 ℃，接入10% Ⅲ號(hào)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液中，并加入Na2SeO3 300～700 mg/L。

培養(yǎng)條件：設(shè)定罐壓0.04～0.05 MPa，罐溫（30±5） ℃，pH 6.0，溶氧60%～100%，攪拌速度190 r/min，發(fā)酵18～24 min得發(fā)酵培養(yǎng)液6.5 L。

1.2.4 無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒效果研究 將發(fā)酵液樣品送至湖北航天化學(xué)技術(shù)研究所分析檢測中心依據(jù)GB/T 5009.93-2003、GB/T 5009.11-2003進(jìn)行硒、總砷和無機(jī)砷的測定，依據(jù)GB/T23942-2009化學(xué)試劑 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法通則，采用等離子體原子發(fā)射光譜儀檢測分析發(fā)酵液有機(jī)硒含量，參照杭州市農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范DB3301消解無機(jī)硒的方法處理樣品，測定無機(jī)硒。總硒和無機(jī)硒的差值為有機(jī)硒含量，若未檢出無機(jī)硒，則總硒即為有機(jī)硒。

1.2.5 Ⅲ號(hào)菌株的初步鑒定 以《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》為指導(dǎo)，參考《一般細(xì)菌常用鑒定方法》、《中華人民共和國藥典》2015版四部9204微生物鑒定指導(dǎo)原則，對(duì)微生物的生理生化性質(zhì)進(jìn)行分析，判定出該微生物的種屬關(guān)系。

1）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：取純化的試管斜面，用10 mL無菌水沖洗斜面，獲得菌種懸液。吸取稀釋后的菌液，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)胞形態(tài)。

2）菌落觀察：取純化的試管斜面，用10 mL無菌水沖洗斜面，獲得菌種懸液。用濃度梯度稀釋法，將菌懸液稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h形成單菌落，對(duì)菌落進(jìn)行觀察。

3）硝酸鹽還原性檢測：將分離純化的Ⅲ號(hào)菌株接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)1～4 d。將甲（氨基苯磺酸0.8 g，5 mol/L醋酸100 mL）、乙（α-萘胺0.5 g，5 mol/L醋酸100 mL）等量混合液（用時(shí)混合）0.1 mL加于試管內(nèi)，以一支未接種細(xì)菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照。出現(xiàn)紅色反應(yīng)則為陽性，否則為陰性；若對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)管為陽性，則檢測結(jié)果陽性；若對(duì)照管和試驗(yàn)管均為陽性，則檢測結(jié)果假陽性。

4）運(yùn)動(dòng)性檢查：用解剖針穿刺接種分離純化得到的微生物于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)。30 ℃，恒溫培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿對(duì)透射光目測。微生物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示該菌種無運(yùn)動(dòng)性；若生長物不僅生長在穿刺線上且向四周呈云霧狀擴(kuò)散，或穿刺線上生長物很少，從穿刺線表面向下滲入有生長物，則表示該菌種有運(yùn)動(dòng)性。

5）接觸酶檢測：用解剖針挑取培養(yǎng)好的單菌落，涂抹于滴有一滴3%過氧化氫的載玻片上，如果氣泡產(chǎn)生則為陽性，若沒有氣泡產(chǎn)生則為陰性。

6）明膠液化檢測：挑取生長良好、大小適中的菌落針刺接種于明膠培養(yǎng)基，另取兩支空白培養(yǎng)基試管斜面，用無菌解剖針穿刺。22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d觀察試管斜面菌落生長狀況和明膠液化程度。若有明顯菌落生長且培養(yǎng)基無明顯凹陷或液化，則為陰性；若無菌落生長，明膠凝塊部分或全部變?yōu)榭闪鲃?dòng)的液體，則為假陽性；若有菌落生長，且明膠有明顯液化或凹陷，則為陽性。

7）糖代謝檢測和產(chǎn)酸檢測：將分離純化的試管菌種分別接種到加有不同糖類的糖代謝培養(yǎng)基中，觀察微生物生長狀況和指示劑顏色反應(yīng)。若微生物正常生長且指示劑變色，則可以判定該微生物顆粒利用此種糖類，且該微生物產(chǎn)酸。

8）Ⅲ號(hào)菌種的16S rRNA序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析：將Ⅲ號(hào)純化試管菌種送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）測序，并將核酸序列檢測結(jié)果通過NCBI進(jìn)行BLAST-nucleotide分析，并進(jìn)行16S rRNA序列同源性比對(duì)，選取與其同源性較高的基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其種屬關(guān)系。

1.2.6 水稻中有機(jī)硒含量的測定 將富硒發(fā)酵液梯度稀釋后對(duì)水稻根外噴施，對(duì)水稻植株及大米中硒含量進(jìn)行檢測，分析水稻植株對(duì)硒的利用率及大米中的有機(jī)硒含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株SE201412形態(tài)學(xué)特征

通過觀察，革蘭氏染色為紫色，即陽性菌，菌株形態(tài)特征為桿狀，芽孢直徑小于1 μm，且菌體不膨大，鞭毛側(cè)生，符合芽孢桿菌形態(tài)特征（圖1）。通過菌株平板菌落形態(tài)觀察，該菌落表面粗糙不透明，污白色（圖2）。

2.2 生理生化特征

Ⅲ號(hào)菌生理生化特征的檢測項(xiàng)目及結(jié)果如表1所示，具體分析如下。

2.2.1 硝酸鹽還原性檢測 在試驗(yàn)管中加入混合液3 min后顏色開始變化，8 min后紅色變化明顯為陽性，對(duì)照管顏色始終無變化，為陰性，故檢測結(jié)果為陽性。即該菌種可以將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。表明該微生物具有硝酸鹽代謝途徑，符合枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生化特點(diǎn)。

2.2.2 運(yùn)動(dòng)性檢查 培養(yǎng)48 h后對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行透射光目測。發(fā)現(xiàn)微生物不僅生長在穿刺線上，穿刺線邊緣不清晰，穿刺線四周也有明顯菌落生長。部分穿刺線周圍出現(xiàn)霧狀菌落，有沿著穿刺線表面向下生長的狀況。表明該菌種有運(yùn)動(dòng)性，符合枯草芽孢桿菌特性。

2.2.3 接觸酶檢測 用解剖針挑取培養(yǎng)24 h的單菌落，涂抹于滴有一滴3%過氧化氫的載玻片上，有少許氣泡產(chǎn)生，接觸酶檢測呈陽性。

2.2.4 明膠液化檢測 該菌株在22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天開始出現(xiàn)明顯菌落。第三天菌落處出現(xiàn)培養(yǎng)基凹陷。培養(yǎng)觀察7 d后，培養(yǎng)基液化達(dá)到1 cm，明膠液化呈陽性。表明該微生物具有蛋白酶活性，具有枯草芽孢桿菌明膠液化代謝特點(diǎn)。

2.2.5 糖代謝檢測和產(chǎn)酸檢測 將分離純化的試管菌種分別涂抹于阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖、甘露醇等糖、醇代謝培養(yǎng)基中，該菌生長狀況良好，培養(yǎng)3 d后出現(xiàn)明顯菌落，培養(yǎng)基變黃色。故可以判定該微生物可以利用多種糖、醇且該微生物發(fā)酵產(chǎn)酸。說明該菌具有阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖、甘露醇等糖、醇代謝途徑，符合枯草芽孢桿菌的糖代謝和產(chǎn)酸的特點(diǎn)。

2.3 SE201412菌株16S rRNA同源性分析

對(duì)菌株SE201412進(jìn)行16S rRNA基因序列分析（圖3）。16S rRNA基因序列長度為1 383 bp。

將SE21412菌株16S rRNA基因序列通過NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，在GenBank中，38個(gè)與SE21412菌株同源性較高的菌株比對(duì)結(jié)果見表2。

利用NCBI在線工具，構(gòu)建菌株Se201412系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。菌株SE201412所在最大分支中所包含的全部菌株均為芽孢桿菌屬，初步鑒定SE201412屬于芽孢桿菌屬。且該菌株與Genbank中的登記序列Bacillus subtilis DSM10（AJ276351）的枯草芽孢桿菌同屬于一個(gè)最小次級(jí)分支。并與枯草芽孢桿菌庫16S rRNA有99%同源性，因此，鑒定該菌屬于枯草芽孢桿菌屬，是枯草芽孢桿菌屬中枯草芽孢桿菌種的一個(gè)新菌株，命名為Bacillus subtilis SE201412。

2.4 加入SE201412菌發(fā)酵后無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的效果

SE201412菌通過發(fā)酵可將一定比例的亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，其中，一部分的有機(jī)硒溶于發(fā)酵液中，一部分被菌合成自身的營養(yǎng)物質(zhì)。如表3所示，在SE201412菌發(fā)酵液中加入亞硒酸鈉300～700 mg/L，可以100%轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。表明SE201412是嗜硒菌，在高硒濃度下生長良好，有較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.5 SE201412發(fā)酵富有機(jī)硒菌液在水稻生產(chǎn)中的應(yīng)用

用Na2SeO3根外噴施作物，其利用率不超過20%，80%的硒被浪費(fèi)，且稻米中有機(jī)硒含量不高。SE201412發(fā)酵富硒菌液根外噴施水稻植株，水稻植株對(duì)硒的利用率為51.26%～64.12%，大米有機(jī)硒占總硒比例為83.4%～84.9%（表4）。表明SE201412發(fā)酵富硒菌液可以提高亞硒酸鈉的利用率，尤其是可生產(chǎn)出達(dá)到DBS42/002-2014標(biāo)準(zhǔn)的富有機(jī)硒農(nóng)產(chǎn)品。

3 小結(jié)與討論

本研究通過對(duì)從恩施市白楊鄉(xiāng)煙草廢棄物提取煙堿前處理物中分離得到的一種枯草芽孢桿菌SE201412進(jìn)行形態(tài)、生理生化特征[18，19]、基因序列分析[20]，表明其是一株新的枯草芽孢桿菌菌株，命名為Bacillus subtilis SE201412。該菌株有較強(qiáng)的將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的能力，利用該菌株生產(chǎn)的富有機(jī)硒菌劑可以生產(chǎn)出達(dá)標(biāo)的富有機(jī)硒農(nóng)產(chǎn)品。應(yīng)用Bacillus subtilis SE201412對(duì)亞硒酸鈉進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，得到的發(fā)酵液以不同硒濃度（以Se計(jì)）用于水稻根外噴施生產(chǎn)富有機(jī)硒水稻，可使水稻有機(jī)硒含量最高達(dá)0.365 mg/kg，硒的利用率最高達(dá)到64.12%，稻米中總硒含量最高達(dá)0.432 mg/kg，有機(jī)硒占總硒的比例最高達(dá)84.9%，具有較高的學(xué)術(shù)和應(yīng)用價(jià)值。

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