馬祥+祁月紅+衛(wèi)建峰+李燕則+畢競(jìng)+呂磊+郭永清

[摘要]目的 采用FX-4000TTM柔性基底加載系統(tǒng)建立體外大鼠脊髓源性少突膠質(zhì)前體細(xì)胞機(jī)械拉伸損傷模型，為進(jìn)一步探討少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在脊髓損傷及修復(fù)過(guò)程中的作用及機(jī)制提供模型基礎(chǔ)。方法 采用振搖法體外純化培養(yǎng)大鼠脊髓少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，并進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞鑒定。將純化培養(yǎng)3 d的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞隨機(jī)分為A組（對(duì)照組）、B組（拉伸強(qiáng)度5%）、C組（拉伸強(qiáng)度10%）、D組（拉伸強(qiáng)度15%）。采用FX-4000TTM柔性基底加載系統(tǒng)機(jī)械拉伸少突膠質(zhì)前體細(xì)胞2 h后，通過(guò)倒置顯微鏡觀(guān)察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率、雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，對(duì)損傷模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 體外成功培育少突膠質(zhì)前體細(xì)胞且純度>90%。B組拉伸強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞形態(tài)及存活沒(méi)有明顯影響，基本不構(gòu)成損傷。C組和D組細(xì)胞存活率較A組顯著降低（P<0.05），凋亡率也明顯升高（P<0.05），并出現(xiàn)明顯病理性形態(tài)改變；但D組有明顯的細(xì)胞脫落現(xiàn)象且細(xì)胞存活率降到<50%，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。結(jié)論 采用FX-4000TTM柔性基底加載系統(tǒng)以10%為拉伸強(qiáng)度可建立有效的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞機(jī)械拉伸損傷模型。

[關(guān)鍵詞]少突膠質(zhì)前體細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；體外模型；機(jī)械拉伸；脊髓損傷

[中圖分類(lèi)號(hào)] R-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）12（c）-0004-04

The establishment and evaluation of a model of stretch-induced mechanical injury on cultured oligodendrocyte precursor cells from neonatal rat spinal cord in vitro

MA Xiang1 QI Yue-hong2 WEI Jian-feng2 LI Yan-ze1 BI Jing1 LYU Lei1 GUO Yong-qing2

1.College of Anaesthesiology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Department of Anaesthesiology，People′s Hospital Affiliated to Shanxi Medical University in Shanxi Province，Taiyuan 030012，China

[Abstract]Objective To establish a model of stretch-induced mechanical injury on cultured oligodendrocyte precursor cells （OPCs） in vitro with the FX-4000TTM system，in order to further explore the role and mechanism of OPCs in spinal cord injury and repair.Methods OPCs were separated from spinal cord of neonatal rats and then purified with the shaking method in vitro.Immunofluorescence assay was applied to identify the separated cells.A FX-4000TM system was used to apply cyclic stretch.The purified OPCs were randomly divided into four groups：group A （control group），group B （5% tensile strain），group C （10% tensile strain），group D（15% tensile strain）.After OPCs were strained for 2 h by the FX-4000TTM system，morphology of OPCs was observed by using inverted microscope，viability of OPCs was measured by MTT assay and apoptosis of the cells was detected by double staining flow cytometry，damage models were evaluated.Results The percentage of purified OPCs in vitro was more than 90%.There were no significant differences between group A and group B in survival rate and cell morphology.Compared with group A，survival rate of OPCs in group C and D was significantly decreased （P<0.05），apoptosis rate of OPCs was significantly increased （P<0.05），and obvious pathological morphologic changes of OPCs were also observed in group C and D.However，there was a large loss of cell attachment and survival rate of OPCs was found to be less than 50% in group D.Conclusion The model of stretch-induced mechanical injury on cultured OPCs can be established by applying 10% tensile strain with the FX-4000TTM system.

[Key words]Oligodendrocyte precursor cells；Cell culture；In vitro model；Mechanical strain；Spinal cord injury

隨著現(xiàn)代交通和建筑工業(yè)的快速發(fā)展，脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的發(fā)病率逐年增加，并成為青年人致殘的主要原因之一[1-2]。SCI是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系創(chuàng)傷，其原發(fā)的機(jī)械損傷及貫序的炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，均可導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞大量死亡，引發(fā)廣泛脫髓鞘病變，造成不可逆的神經(jīng)功能缺失[3-4]。SCI后具有髓鞘修復(fù)能力的細(xì)胞主要是位于白質(zhì)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs），它們能對(duì)SCI作出快速響應(yīng)并增殖分化為具有髓鞘生成能力的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，參與SCI的修復(fù)[5-6]。因此，獲得一種簡(jiǎn)單高效的OPCs培養(yǎng)方法，并建立其體外機(jī)械損傷模型，對(duì)進(jìn)一步研究SCI后髓鞘修復(fù)及軸突再生的機(jī)制具有重要意義。

本研究培養(yǎng)大鼠脊髓OPCs并通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的FX-4000TTM柔性基底拉伸系統(tǒng)建立體外細(xì)胞機(jī)械拉伸損傷模型，以期為進(jìn)一步探討SCI后OPCs增殖活化的機(jī)制建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生（出生48 h內(nèi)）清潔級(jí)SD大鼠，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要儀器和試劑

HERAcell 150i培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國(guó)）、恒溫定軌搖床（國(guó)華，上海）、IX73熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本）、FX-4000TTM柔性基底加載系統(tǒng)（Flexcell，美國(guó)）、伯樂(lè)680型酶標(biāo)儀（Bio-rad，美國(guó)）、BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）。

胎牛血清（Gibco，美國(guó)）、DMEM（Gibco，美國(guó)）、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基OPCM（含PDGF-AA和bFGF，Sciencell，美國(guó)）、胰蛋白酶（博士德，武漢）、多聚賴(lài)氨酸（Sigma，美國(guó)）、鼠抗A2B5抗體（Millipore，美國(guó)）、TRITC-免疫熒光二抗（博士德，武漢）、DAPI染色液（博士德，武漢）、MTT試劑（Sigma，美國(guó)）、Annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒（生工，上海）。

1.3方法

1.3.1 OPCs的分離純化培養(yǎng)與鑒定 本實(shí)驗(yàn)參考Chen等[7]的振搖法進(jìn)行原代大鼠OPCs的體外培養(yǎng)。取新生48 h內(nèi)SD大鼠脊髓，經(jīng)胰蛋白酶消化15 min后中和消化，用含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸并接種于預(yù)先多聚賴(lài)氨酸包被的75 cm2培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)至10 d時(shí)，可見(jiàn)大量的OPCs伏趴在星形膠質(zhì)細(xì)胞上層。將培養(yǎng)瓶固定在37℃的恒溫水平搖床上，200 r/min預(yù)震蕩1 h以去除小膠質(zhì)細(xì)胞；繼續(xù)以200 r/min振搖過(guò)夜，取細(xì)胞上清接種于未包被的培養(yǎng)皿中孵育40 min以去除多余的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，即可獲得純化的OPCs。使用OPCs培養(yǎng)基OPCM制備OPCs單細(xì)胞懸液，以1×105/cm2的密度接種于鋪有多聚賴(lài)氨酸預(yù)包被蓋玻片的6孔板中，每隔一天半量換液。

取純化培養(yǎng)3 d的OPCs進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞染色。4%的多聚甲醛室溫固定20 min，漂洗后，Triton X-100破膜，5%BSA室溫下封閉30 min。加入稀釋的A2B5抗體（1∶200）于4℃過(guò)夜，次日，PBS漂洗后加入TRITC-羊抗小鼠二抗（1∶100）避光孵育1 h，DAPI染核5 min，PBS洗滌后，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下做免疫熒光細(xì)胞鑒定。陰性對(duì)照組使用PBS替代一抗，其余步驟相同。

1.3.2 OPCs機(jī)械拉伸損傷模型的建立 本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞機(jī)械損傷系統(tǒng)由FX-4000TTM柔性基底拉伸裝置和BioFlex培養(yǎng)板組成。取純化的OPCs接種于多聚賴(lài)氨酸預(yù)包被的BioFlex培養(yǎng)板中培養(yǎng)3 d后，將培養(yǎng)板與FX-4000TTM柔性基底拉伸裝置相連接，以實(shí)施對(duì)細(xì)胞的機(jī)械拉伸損傷。根據(jù)系統(tǒng)拉伸強(qiáng)度的大小，將實(shí)驗(yàn)分為A組（對(duì)照組）、B組（拉伸強(qiáng)度5%）、C組（拉伸強(qiáng)度10%）、D組（拉伸強(qiáng)度15%），加載時(shí)間都固定2 h，其他加載參數(shù)均為：頻率0.1 Hz，正弦波。加載完成后于倒置顯微鏡下觀(guān)察各組細(xì)胞形態(tài)。對(duì)照組同樣接種在BioFlex培養(yǎng)板中與損傷組置于同一孵育箱，但不與拉伸裝置相連。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組加載完成后，隨即每孔加入MTT試劑150 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，培養(yǎng)終止后倒板。每孔加入DMSO 1.2 ml，37℃震蕩15 min，使甲瓚結(jié)晶完全溶解。轉(zhuǎn)移甲瓚溶液至96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度OD值。細(xì)胞存活率=損傷組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.3.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組加載完成后，隨即每孔加入0.5 ml胰蛋白酶（不含EDTA），待細(xì)胞突起縮回中止消化，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。用Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞密度為（1～5）×105/ml，加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻后再加入10 μl PI染液，室溫避光孵育15 min，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey事后檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 OPCs體外培養(yǎng)的觀(guān)察及鑒定

按振搖法純化的OPCs經(jīng)OPCM培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞呈圓形或光滑的橢圓形，細(xì)胞體積較小，折光性強(qiáng)，大多數(shù)具有典型的雙極突起，少部分為三極突起（圖1A）。進(jìn)一步采用OPCs特異性抗體A2B5標(biāo)記后，結(jié)果顯示A2B5陽(yáng)性細(xì)胞比例>90%（圖1B），陰性對(duì)照未見(jiàn)熒光。

2.2 OPCs拉伸損傷后病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察

機(jī)械損傷前后，相差顯微鏡下可見(jiàn)OPCs發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)變化。對(duì)照組OPCs貼壁良好，突起伸展自然，折光性強(qiáng)，形態(tài)正常（圖2A）。5%形變拉伸后，B組OPCs形態(tài)飽滿(mǎn)，細(xì)胞間隙略有增大，與A組無(wú)明顯差異（圖2B）；10%形變拉伸后，C組細(xì)胞可見(jiàn)有部分包體腫脹，胞質(zhì)折光減弱，突起略有拉長(zhǎng)，但細(xì)胞仍然附著于硅膠膜上不脫落（圖2C）；15%形變拉伸后，D組細(xì)胞胞體變圓，突起斷裂，呈無(wú)極性散在分布，細(xì)胞脫落嚴(yán)重（圖2D）。

2.3 OPCs拉伸損傷后細(xì)胞存活率的變化

MTT法測(cè)定損傷后細(xì)胞存活率，A組細(xì)胞存活率為（99.93±4.03）%，B組為（95.48±7.66）%，C組為（72.97±8.89）%，D組為（45.05±4.816）%。5%拉伸強(qiáng)度對(duì)B組細(xì)胞存活率并無(wú)明顯影響；與A組細(xì)胞相比，C組和D組細(xì)胞存活率顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但D組由于力學(xué)荷載過(guò)大致使細(xì)胞存活率降到<50%，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

2.4 OPCs拉伸損傷后細(xì)胞凋亡率的變化

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，A組凋亡率為（3.69±1.14）%，B組為（4.91±1.52）%，C組為（15.28±2.01）%，D組為（33.01±4.15）%。B組細(xì)胞凋亡率和A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；C組和D組隨著拉伸強(qiáng)度的增加細(xì)胞凋亡率逐漸增加，均明顯高于A(yíng)組（P<0.05）。

3討論

OPCs是具有干細(xì)胞特性的未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，20世紀(jì)80年代初被Raff等[8]首次發(fā)現(xiàn)后至今，因其既能定向誘導(dǎo)分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)又具有良好的增殖遷移能力，故一直是SCI后治療的研究熱點(diǎn)[9-10]。筆者通過(guò)體外培養(yǎng)獲得了高純度OPCs，并使用細(xì)胞拉伸損傷模型合理地模擬了SCI對(duì)OPCs的原發(fā)性損害，為進(jìn)一步探討OPCs在脊髓的損傷及修復(fù)過(guò)程中的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)工具。

目前已報(bào)道的OPCs體外培養(yǎng)的方法有很多，包括振搖法、免疫吸附法、干細(xì)胞克隆球誘導(dǎo)分化法等[7，11-12]，筆者綜合比較了幾種方法后采用振搖法，規(guī)避了前幾種方法操作復(fù)雜、成本高昂、產(chǎn)率低等缺陷，從大鼠乳鼠脊髓中獲得純度較高且增殖旺盛的OPCs。隨著神經(jīng)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)的日趨成熟，體外機(jī)械損傷的細(xì)胞模型已廣泛用于SCI的研究中，但關(guān)于OPCs的機(jī)械損傷模型報(bào)道尚少。離體損傷模型相對(duì)于動(dòng)物模型更有利于實(shí)驗(yàn)條件的精確控制和對(duì)細(xì)胞內(nèi)事件的深入研究，是探索SCI發(fā)病機(jī)制和治療方案的有效手段[13]。目前常用的神經(jīng)細(xì)胞機(jī)械損傷模型有切割損傷模型、牽張損傷模型、壓迫損傷模型、液壓動(dòng)力損傷模型、加速/減速損傷模型等，可以分別通過(guò)切割、拉伸與擠壓、剪切等方式來(lái)模仿神經(jīng)損傷的不同形式[14-16]。在SCI的研究中人們發(fā)現(xiàn)，亞致死量損傷的神經(jīng)細(xì)胞可以激發(fā)二次損傷的信號(hào)通路，是繼發(fā)性損傷的主要受累細(xì)胞，故亞致死的神經(jīng)元是目前人為干預(yù)治療的最佳目標(biāo)。與其他損傷模型相比，由FX-4000TTM柔性基底加載系統(tǒng)建立的拉伸損傷模型是目前公認(rèn)的研究亞致死量損傷的最佳選擇[17-18]。FX-4000TTM柔性基底加載系統(tǒng)可以為細(xì)胞提供均勻可控的周期性應(yīng)力，使細(xì)胞在損傷過(guò)程中同時(shí)承受壓縮和拉伸的應(yīng)力變化[19-20]，可較為接近地模擬真實(shí)SCI過(guò)程。

如前所述，筆者采用了5%、10%、15%三個(gè)拉伸強(qiáng)度去打擊細(xì)胞，為評(píng)價(jià)損傷程度又觀(guān)察了細(xì)胞病理形態(tài)、檢測(cè)了受損細(xì)胞的存活率和凋亡情況。通過(guò)這種方式制作的細(xì)胞機(jī)械損傷模型，筆者觀(guān)察到OPCs不僅出現(xiàn)了形態(tài)學(xué)的病理變化，還出現(xiàn)了細(xì)胞存活率的降低和凋亡率的顯著增高，這些結(jié)果都證明此損傷模型是制作成功的。但是，筆者發(fā)現(xiàn)15%拉伸強(qiáng)度的重度損傷，細(xì)胞存活率已下降超過(guò)一半，細(xì)胞大面積脫落，對(duì)細(xì)胞的打擊是毀滅性的，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，急性拉伸強(qiáng)度>11%會(huì)引起神經(jīng)元嚴(yán)重的不可逆損害，事實(shí)上，神經(jīng)細(xì)胞一般都承受不了11%這個(gè)閾值[21]。然而，6%以下拉伸強(qiáng)度所引起的神經(jīng)細(xì)胞改變是生理性的[22]。有研究表明，在5%的拉伸刺激下，雪旺細(xì)胞的增殖指數(shù)要明顯高于對(duì)照組，提示接近生理性拉伸應(yīng)變可能提高細(xì)胞活性。本研究中發(fā)現(xiàn)，在5%拉伸強(qiáng)度下，OPCs凋亡和細(xì)胞活性基本與A組無(wú)異，推測(cè)5%的拉伸應(yīng)變對(duì)OPCs來(lái)說(shuō)可能也屬生理性刺激。然而SCI時(shí)瞬間的沖力所造成的創(chuàng)傷往往不是生理性刺激，故5%的輕度拉伸并沒(méi)有達(dá)到損傷標(biāo)準(zhǔn)，不能作為建模的有效損傷強(qiáng)度。5%拉伸接近生理性刺激對(duì)OPCs基本不構(gòu)成損傷；15%拉伸強(qiáng)度由于力學(xué)荷載過(guò)大對(duì)OPCs造成毀滅性打擊；而10%拉伸組細(xì)胞損傷明顯且無(wú)脫落現(xiàn)象，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，故筆者初步確定10%為OPCs機(jī)械損傷模型的拉伸強(qiáng)度，并作為進(jìn)行下一步研究的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，本文在脊髓OPCs體外純化培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，建立了簡(jiǎn)單而又行之有效的OPCs機(jī)械拉伸損傷模型，為細(xì)胞水平研究SCI提供了科學(xué)的保證。然而，SCI后OPCs發(fā)生凋亡和壞死的機(jī)制目前還不甚清楚，有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白失衡是導(dǎo)致OPCs凋亡的重要原因之一，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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