王文昌++周雙云++喬飛++吉福桑++李元元++李新國

摘 要 研究巴西蕉幼苗在60 mmol/L NaCl人工模擬的鹽脅迫0、4、8、12、24和48 h不同時間下，通過增加外源CaCl2和鈣離子螯合劑EGTA處理后，測定其葉片和根的鈣調(diào)蛋白（CaM）含量的變化。結(jié)果表明，與對照處理相比，在NaCl脅迫過程中，葉片CaM含量在4、8、12 h顯著增加而在24和48 h顯著減少；根的CaM含量則是在4、12、24 h顯著增加，在8 h顯著降低。在NaCl脅迫中添加CaCl2處理能顯著提高CaM含量，而在NaCl脅迫中添加EGTA處理能顯著降低CaM含量。以上說明，通過CaM的含量變化，鈣信號系統(tǒng)參與香蕉的耐鹽調(diào)控。

關(guān)鍵詞 巴西蕉幼苗 ；鹽脅迫 ；CaM含量

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.003

The Change of CaM content in Brazil Banana Seedlings under Salt Stress

WANG Wenchang1，2） ZHOU Shuangyun2）

QIAO Fei3） JI Fusang1） LI Yuanyuan1） LI Xinguo1）

（1 College of Horticulture and Landscape Architecture，HainanUniversity， Haikou， Hainan 570228；

2 Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007；

3 Tropical Crops Genetic Resource Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract Brazil banana seedlings were treated with salt under 60 mmol/L NaCl salt stress environment at 0， 4， 8， 12， 24 or 48 h and added with exogenous CaCl2 and calcium chelator EGTA to determine their CaM content in roots and leaves. The results showed that the CaM content of the leaves significantly increased at 4 h， 8 h or 12 h and significantly decreased at 24 h or 48 h under NaCl stress as compared to the control. The CaM content of the roots significantly increased at 4 h， 12 h or 24 h， and significantly decreased at 8 h. The CaM content could significantly increased by adding CaCl2 under the NaCl stress， and significantly decreased by adding EGTA under the NaCl stress. This indicates that calcium signaling system may be involved in the salt regulation of banana through the change of CaM content.

Keywords Brazil banana seedling ； Salt stress ； CaM content

鈣調(diào)蛋白（CaM）是真核細胞中最為保守的蛋白之一，也是研究最廣泛和深入的Ca2+傳感蛋白[1]，它是一類分布最廣、具有重要生物學功能的Ca2+受體蛋白。CaM自身沒有激酶活性，必須通過結(jié)合Ca2+形成Ca2+-CaM復合體，才能誘導分子構(gòu)象發(fā)生改變從而激活下游各類靶蛋白[2]。相關(guān)研究表明[3-5]，當受到逆境脅迫時，植物能通過提高細胞質(zhì)游離Ca2+的濃度，并通過 Ca2+與CaM 結(jié)合，啟動一系列生理生化過程，從而在作物對逆境脅迫的感受、傳遞、響應和適應過程中發(fā)揮重要作用。鈣作為重要的第二信使，參與許多植物對逆境信號的轉(zhuǎn)導。Ca2+-CaM信號途徑在植物應對各種脅迫及調(diào)控生長發(fā)育中起著不可忽視的作用[6]。我們前期研究證明，鈣參與香蕉調(diào)控鹽脅迫生理機制。但是，在鈣信號啟動過程中，CaM含量的變化還未見報道[7-8]。本研究以巴西蕉幼苗為試材研究鹽脅迫下CaM含量的變化，旨在為研究香蕉逆境脅迫下的反應信號傳導變化及適應調(diào)節(jié)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料選自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院種苗組培中心的巴西蕉（Musa AAA Cavendish var. Brazil）幼苗，苗高約25 cm，粗度基本一致，五葉一心，心葉未展開，無病蟲害。將袋裝巴西蕉幼苗取出，經(jīng)去土洗凈根系后轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland營養(yǎng)液進行水培，每3 d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為：光照強度75 μmol/（m2·s），光照時間14 h/d，晝夜溫度27℃/21℃，相對濕度85%～90%，培養(yǎng)期間用電動氣泵全天持續(xù)對營養(yǎng)液通氣。預培養(yǎng)6 d后設(shè)置對照、60 mmol/L NaCl、60 mmol/L NaCl+5 mmol/L CaCl2和60 mmol/L NaCl+10 mmol/L EGTA 4種處理。分別處理0、4、8、12、24和48 h后取材。分別稱取0.10 g的葉片和根，液氮速凍，-80℃下保存?zhèn)溆谩?

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

巴西蕉幼苗葉片和根的CaM含量采用 ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫法）測定，按照上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供的植物CAM ELISA試劑盒方法進行。CaM含量的提取，參考羅充[9]的方法，略作修改，測定時取準備好的冷凍各樣品0.10 g，用樣品提取液（50 mmol/L Tris-HCl緩沖液pH=7.5；1 mmol/L的EGTA；0.15 mol/L NaCl；0.5 mmol/L PMSF；20 mmol/L的NaHCO3）稀釋10倍，在冰浴中研磨并勻漿，然后倒入冷凍離心機的離心管內(nèi)，在92℃下加熱3 min后又立即放入冰浴中冷卻，離心管相互平衡后在冷凍離心機中離心（4℃、0.5 h、12 000 r/min），上清液吸入洗凈的離心管內(nèi)，低溫-4℃冰箱保存。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS 7.05軟件進行差異顯著性檢驗，多重比較分析采用DUNCAN新復極差法。

2 結(jié)果與分析

如圖1示，與CK處理相比，巴西蕉幼苗葉片在60 mmol/L的NaCl脅迫下，CaM含量在4、8、和12 h處理顯著增加（P<0.05），其它時間處理均顯著降低；在NaCl脅迫中添加CaCl2處理，除0 和48 h無顯著變化外，其它時間處理顯著增加（P<0.05）；在NaCl脅迫中添加EGTA處理，不同時間處理CaM含量均顯著降低（P<0.05）。與NaCl脅迫相比，在NaCl脅迫中添加CaCl2處理，除0和8 h處理無顯著變化外，其它時間處理均顯著增加（P<0.05）；在NaCl脅迫中添加EGTA處理，不同時間處理均顯著降低（P<0.05）。CK處理、NaCl處理和NaCl脅迫中添加CaCl2處理的變化趨勢一樣，均呈先下降再上升最后再下降的趨勢，只是下降和上升的幅度和時間表現(xiàn)不同；NaCl脅迫中添加EGTA處理，CaM含量呈下降趨勢。CK處理在4 h時，CaM含量顯著降低（P<0.05），4和8 h時無顯著變化，在12 和24 h顯著增加，24 h達到峰值，在48 h又顯著降低；NaCl處理4 h時顯著降低，8 h又顯著增加，在12～48 h則顯著降低；NaCl脅迫中添加CaCl2處理在4 h顯著降低，在8 h顯著增加，在12 h變化不明顯，在24和48 h顯著降低。

巴西蕉幼苗根的CaM含量，與CK處理相比，在NaCl脅迫下，0 h和48 h未發(fā)生顯著變化，4、12和24 h顯著增加，8 h顯著降低；在NaCl脅迫中添加CaCl2處理，不同時間處理均顯著增加（P<0.05）；在NaCl脅迫中添加EGTA處理，不同時間處理均顯著降低（P<0.05）。與NaCl脅迫相比，NaCl脅迫中添加CaCl2處理，除處理0和4 h無顯著變化外，其它時間處理均顯著增加；NaCl脅迫中添加EGTA處理，不同時間均呈現(xiàn)顯著下降（P<0.05）。CK處理呈現(xiàn)雙波谷的趨勢，NaCl處理呈現(xiàn)先下降再上升最后再下降的趨勢，NaCl脅迫中添加EGTA處理呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，NaCl脅迫中添加EGTA處理呈現(xiàn)下降的趨勢。CK處理在4 h顯著降低，在8 h顯著增加，12和24 h顯著降低，48又顯著增加；NaCl處理在4 h無顯著變化，在8 h顯著降低，在12 h顯著增加，在24 和48 h則顯著降低；在NaCl脅迫中添加CaCl2處理，在4 和8 h微顯著上升，在12 h顯著增加（P<0.05），在24 和48 h顯著下降；在NaCl脅迫中添加EGTA處理在4 h顯著降低，在4～48 h未發(fā)生顯著變化。

3 討論

植物在受到非生物刺激諸如鹽脅迫時，會普遍產(chǎn)生Ca2+信號，此時，鈣調(diào)蛋白（CaM）濃度會發(fā)生變化，作為靶酶本身不起作用與鈣相結(jié)合，進而來調(diào)節(jié)逆境脅迫[10-12]。近年來，在植物逆境脅迫方面，CaM的作用在很多研究領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注[13-14]。當植物遭受鹽脅迫時，植物細胞質(zhì) Ca2+濃度增加[15]。孫靜文[16]指出，蘋果補鈣可以提高細胞內(nèi)CaM含量；吳錦程[17]研究發(fā)現(xiàn)，鈣處理顯著提高了低溫脅迫后枇杷幼苗葉片細胞CaM含量；林善枝[18]指出，添加CaCl2處理的低溫鍛煉幼苗，其CaM含量有較大幅度增加；本研究也發(fā)現(xiàn)，巴西蕉幼苗葉片的CaM含量，在鹽脅迫除了8 h之外均顯著增加，而根的CaM含量在鹽脅迫8 h之后才均顯著增加。這說明在NaCl脅迫當中，添加CaCl2處理會增加CaM的含量。在顯著增加當中，根的CaM含量相對于葉的CaM含量來得多，說明在受到鹽脅迫時，巴西蕉幼苗根對逆境的調(diào)節(jié)比葉片來得高些。

EGTA 處理降低可溶性Ca 和CaM的含量[19]，而羅充[20]指出，EGTA處理降低植株Ca2+的含量，但對CaM含量變動規(guī)律性不大。加鈣螯合劑能明顯抑制柑橘原生質(zhì)體杭凍性的表達，其中，CaM調(diào)節(jié)原生質(zhì)體的抗凍性[21]。EGTA處理在干旱脅迫下楊樹幼苗葉片的CaM含量明顯增加[22]。干旱脅迫在一定程度上提高了CaM含量，而且添加外源鈣后更有利于鈣信號的傳遞，但添加各種抑制劑后，CaM含量降低[23]；本研究發(fā)現(xiàn)，在NaCl脅迫下添加EGTA處理，CaM含量顯著降低。

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① 基金項目：國家自然科學基金（No.31260462）；海南大學中西部計劃學科建設(shè)項目（No.ZXBJH-XK008）。

收稿日期：2016-08-19；責任編輯/白 凈；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 王文昌（1989～），男，碩士，主要研究方向為園藝植物栽培與生理，E-mail： 297509593@qq.com。

③ 通訊作者。