黃暢+高建軍

摘要：克氏原螯蝦（Procambarus clarkii ）俗稱口味蝦，是我國南方的著名食用蝦，也是目前全世界養(yǎng)殖范圍最廣的淡水螯蝦。我們選擇活體克氏原螯蝦腸道組織為材料，經(jīng)過超聲破碎、高效液相色譜分離、質(zhì)譜和光譜分析、抗菌活性檢測。發(fā)現(xiàn)螯蝦腸道含有一種相對分子質(zhì)量為245.17的新型化合物PC245，其最大吸收波長237nm，同時對嗜水氣單孢菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌作用。實驗結(jié)果表明：該抗菌活性物質(zhì)是一種廣譜、高效的新型抗菌天然產(chǎn)物，

具有潛在的開發(fā)利用價值。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；消化道；抑菌活性；分離；鑒定

人類為了預(yù)防、治療微生物引起的疾病傳播，發(fā)明了多種有效抗菌物質(zhì)，并將它們添加到食品、日用品和保健品中，其中使用最廣泛的就是抗生素。然而由于抗生素類藥物的大量長期使用，導(dǎo)致了耐藥細菌甚至超級細菌的出現(xiàn)，給動植物細菌病的防治帶來了嚴重的挑戰(zhàn)[1]。因此開發(fā)新的抗菌藥物，突破抗生素耐藥性難題，已經(jīng)成為當今世界關(guān)注的焦點和研究的熱點。

從動植物和微生物中提取天然抗菌活性物質(zhì)是尋找新型抗菌藥物的重要途徑，因為天然抗菌活性物質(zhì)具有高效、低毒、無污染和來源廣等特點，可以有效抑制細菌的生長，同時也不會對環(huán)境造成污染，產(chǎn)生抗藥性[2]。

克氏原螯蝦屬甲殼綱，十足目，蝲蛄科，螯蝦亞科，原螯蝦屬，體黑紅色；原產(chǎn)于美國、墨西哥以及古巴的淡水中[3]。日本在1918年作為牛蛙餌料從美國引入，1929年從日本引入我國南京地區(qū)，現(xiàn)主要分布于長江中下游各水域，并成為我國淡水蝦類養(yǎng)殖的一種重要資源；同時又是生態(tài)競爭優(yōu)勢而導(dǎo)致破壞性危害的外來物種[4]。螯蝦可以在滿布細菌、比較骯臟、受污染的水體中生活，同時靠水中腐敗的植物和動物尸體為食的獨特食性，這為研究抗菌肽的多樣性和適應(yīng)性提供了理想的材料，本文以克氏原螯蝦為材料，從消化道分泌物中分離新型抗菌活性化合物，并對其結(jié)構(gòu)和抑菌活性進行研究。

1 材料

1.1 材料?？耸显r從湖南岳陽鄉(xiāng)下購得。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由中南林業(yè)科技大學(xué)提供。

1.2 試劑與儀器。三氟乙酸（TFA），Sigma 公司生產(chǎn)；乙腈，Merck公司生產(chǎn)；HCCA（-氰基- 4-羥基肉桂酸） ，美國ICN 生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀（Alliance 2695與1525），美國Waters公司；C- 18色譜柱（250mm×20.00mm和250mm×4.60mm），美國菲羅門公司；質(zhì)譜儀（MALDI- TOF/ TOF），德國Bruker公司；高速冷凍離心機（5804R），美國Eppendorf公司；高壓滅菌鍋（HVE- 50）美國HIRAYAMA公司。

1.3 培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基： 稱取LB固體培養(yǎng)基1.8 g溶于100 mL蒸餾水中，煮沸至完全溶解，分裝于試管，121℃高壓滅菌20 min，備用。

MH固體培養(yǎng)基（MH瓊脂平板） ： 稱取Mueller- Hinton瓊脂（MHA） 3.8 g溶于100 mL蒸餾水中，煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至55℃傾注平板，備用。

2 方法

2.1 螯蝦腸道抗菌活性物質(zhì)提取。選擇新鮮的克氏原螯蝦，在蝦頭部剪一個口子，然后從該開口處沿蝦背部剪開至蝦尾，得到蝦腸，清除脂肪、腸道內(nèi)容物后剪碎。先用組織搗碎機搗碎，再用超聲波細胞粉碎機破碎10次，每次3s。加入超純水4℃攪拌過夜。次日將混合物于4℃、8000r/min離心30min，取上清液冷凍干燥即為抗菌活性物質(zhì)粗提物。

2.2 反相高效液相色譜純化。第一次反相色譜純化在配備1525泵和2487雙波長檢測器的高效液相色譜系統(tǒng)上進行；收集各洗脫峰，并經(jīng)冷凍干燥后，保存?zhèn)溆?。目的組分第二次反相色譜純化在配備2489雙波長檢測器的Alliance 2695系統(tǒng)上進行；流動相采用二元梯度：A液含0.1%三氟乙酸水溶液，B液含0.1%三氟乙酸的乙腈；檢測波長為280nm與215nm雙波長；柱溫箱為35℃；分析型C- 18色譜柱為（250mm×4.60mm美國菲羅門公司的Lunar柱）。洗脫梯度見表1。

2.3 質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析在Bruker公司Micro- TOF QII上進行。對篩選得到的目標樣品用50%蒸餾水與50%的乙腈溶解后，加入0.1%的甲酸混勻，進樣；霧化氣為氮氣，正離子模式下測定目標組分的相對分子質(zhì)量。

2.4光譜分析。在日立UV2300紫外/可見分光光度儀上進行。波長范圍：200～1100nm；掃描速度：100nm/min；自動切換波長為340nm。將篩選得到的樣品體積100L進行全波長掃描，測定目標組分的吸收波長。

2.5 抑菌活性分析。采用紙片擴散法測定抑菌效果。將試驗菌復(fù)蘇，按0.1%的接種量搖菌培養(yǎng)14- 16h；然后按每平板100- 200 L均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板（ 9 cm），待稍干后貼上無菌濾紙片（6 mm），在各個濾紙片上分別滴加10、20、30、40L各洗脫峰凍干樣品（40 mg/ml）；同時設(shè)置滴加無菌生理鹽水（20 L）為空白對照；4℃靜置3h，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈的大小，以判斷目標樣品的抑菌效果。

3 結(jié)果與分析

3.1螯蝦腸道組織樣品制備。螯蝦腸道組織經(jīng)超聲波破碎提取后，離心并取上清冷凍干燥，粗提樣品為淡黃色粘稠狀的固態(tài)物質(zhì)。粗提樣品的檢測、純化、活性分析，每次用50ml蒸餾水溶解，0.22μm針式過濾頭過濾后待用。

3.2反相高效液相色譜純化。螯蝦腸道組織粗提樣品經(jīng)HPLC分離，在280nm和215nm雙波長檢測條件下，螯蝦腸道組織粗提樣品得到10個比較大的吸收峰，其中保留時間最短為4.75分鐘，最長為30.42分鐘。抑菌試驗篩查實驗顯示色譜純化中保留時間為4.75分鐘的洗脫峰對嗜水氣單孢菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具明顯的抑菌效果。因此，選擇該洗脫峰作為目標組分進行二次純化（見圖1）。

從圖1可看到帶星號的洗脫主峰是目標峰，旁邊還有幾個小峰，洗脫溶液無色透明，說明目標組分通過二次純化后變得更純了。

3.3 質(zhì)譜分析。目標組分經(jīng)質(zhì)譜分析結(jié)果見圖2。從圖可知：目標組分主峰的相對分子質(zhì)量為246.17（M+H+），據(jù)此，將該樣品組分命名為PC245；同時，質(zhì)譜分析圖上沒有出現(xiàn)其它較大的分子離子峰，說明二次反相純化后，目標組分樣品非常純。

3.4光譜分析。目標組分經(jīng)UV2300紫外/可見分光光度儀分析結(jié)果見圖3。從圖3可知：目標組分在237 nm波長處有最大吸收峰，峰值為0.419。

3.5抑菌活性測定。將目標組分PC245對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌的抑菌實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，見圖4、圖5、圖6的抑菌效果。

圖4 PC245對大腸桿菌的抑制作用

圖4沿順時針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40 μL，平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

圖5沿順時針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40μL，平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

圖6沿逆時針方向滴加樣品體積數(shù)分別為10、20、30、40 μL。平板中間的濾紙片滴加無菌生理鹽水作對照。

從圖4、5、6可看到：在濾紙片的周圍出現(xiàn)透明抑菌圈，且抑菌圈的大小隨樣品體積的增加而增大，說明有量、效關(guān)系；同時也可看到PC245對嗜水氣單胞菌的抑菌圈比大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的更大、更清晰、更透明，說明PC245對嗜水氣單胞菌的抑菌效果更好。

4 討論

提取天然抗菌活性物質(zhì)來防治細菌病已經(jīng)成為動植物抗菌制劑開發(fā)的新趨勢。從克氏原螯蝦消化道提取抗菌活性物質(zhì)是找尋抗菌活性化合物的一種新思路[5]。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單孢菌是三種常見的致病菌，其中嗜水氣單胞菌廣泛存在于水體環(huán)境中，是造成淡水蝦、魚類出現(xiàn)敗血癥的病原菌[6]。

本項目將從活體克氏原螯蝦獲得的腸道組織進行超聲破碎提取，經(jīng)高效液相色譜分離純化，得到一種新型化合物PC245；紫外/可見分光光度掃描顯示PC245在237nm波長處的紫外區(qū)具最大吸收波長，分子量比較小，親水性強，推測是一種小分子有機化合物；抑菌實驗證明PC245對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單孢菌均具有抑制效果，而且在相同濃度下，PC245對嗜水氣單孢菌抑制作用更明顯，但是PC245的化學(xué)結(jié)構(gòu)還需進一步確認，其完整生物學(xué)活性也有待更深入的研究。

參考文獻

[1] 馬蘇，高艷美.動物源細菌耐藥性對動物細菌傳染性疾病防治的影響[J].中國獸藥雜志， 2012，（2）：50-52.

[2] 操慶國，國欽，黃敏等.天然抗菌物質(zhì)研究進展[J].保鮮與加工.，2006，（3）：10-12.

[3] 王順昌.克氏螯蝦的生物學(xué)和生態(tài)養(yǎng)殖模式[J].淡水漁業(yè)， 2003， 33（4）： 59-61.

[4]徐加濤等.克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展背景、現(xiàn)狀與展望[J].水產(chǎn)科技情報，2011，38（4）：172-180.

[5] 蘇建明等.草魚腸道抗菌肽的提取及體外抑菌效果初步研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）.2009，35（2）：162-165.

[6] 劉振興等.嗜水氣單胞菌對克氏原螯蝦免疫相關(guān)因子活性的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2011， 30（3）： 358～363.