鄭青青 沈江 沈婷 李秋實 洪朝陽 李文偉

脂肪干細胞對角膜基質(zhì)細胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)及其機制研究

鄭青青 沈江 沈婷 李秋實 洪朝陽 李文偉

目的 探討在體外共培養(yǎng)中，兔脂肪干細胞（ADSCs）對兔角膜基質(zhì)細胞（CSCs）的影響及其作用機制，為角膜基質(zhì)損傷治療提供實驗依據(jù)。方法 取新西蘭大白兔腹股溝皮下脂肪組織，用I型膠原酶消化分離出ADSCs進行培養(yǎng)，貼壁細胞至3代，評價其多向分化能力。另取新西蘭大白兔角膜基質(zhì)層組織，用II型膠原酶消化分離出CSCs，傳代至2代后備用。將CSCs及ADSCs（實驗組）共培養(yǎng)3d后，與單純CSCs（對照組）采用CCK-8法檢測CSCs增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，Western blot法檢測細胞金屬蛋白酶（MMPs）、膠原相關(guān)蛋白水平，評估在體外共培養(yǎng)中ADSCs對CSCs的影響。 結(jié)果 與對照組比較，CCK-8法檢測結(jié)果提示實驗組CSCs數(shù)量顯著增高（P＜0．05），流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示實驗組CSCs細胞凋亡減少，Western blot法檢測結(jié)果提示實驗組MMPs表達水平降低，膠原相關(guān)蛋白表達水平增加。結(jié)論ADSCs不僅可以促進CSCs增殖并抑制其凋亡，還可以促進細胞外基質(zhì)的合成，在角膜基質(zhì)損傷治療中具有較好的應(yīng)用前景。

脂肪干細胞 角膜基質(zhì)細胞 損傷 增殖 基質(zhì)金屬蛋白酶

脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一類存在于脂肪組織基質(zhì)中、具有極強的自我更新和多向分化潛能的干細胞，具有來源豐富、取材方便及對機體損傷小等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)和細胞替代治療[1-4]。ADSCs能夠刺激干細胞微環(huán)境來分化產(chǎn)生所需的干細胞，且具有高度增殖的特性，可以分化成脂肪、骨骼、軟骨、神經(jīng)元和其他細胞譜[5-7]。據(jù)報道，目前我國角膜盲患者接近400萬人，全國每年新增病例達45萬。角膜移植術(shù)是目前角膜盲唯一可靠、有效的治療手段。為了克服角膜來源匱乏和術(shù)后免疫排斥的困難[8]，以細胞為基礎(chǔ)治療角膜損傷是目前一種有前景的治療方法。Nishida等[9]最早嘗試了應(yīng)用口腔黏膜上皮細胞取代角膜緣干細胞治療眼表疾病取得了很好的臨床效果。然而臨床上很多嚴重的眼表疾病都是引起角膜基質(zhì)層損傷而最終致盲，給患者造成了巨大的痛苦[10-11]。因此，臨床上急需具有正常生理功能的組織工程角膜。本實驗通過體外共培養(yǎng)，觀察兔ADSCs對角膜基質(zhì)細胞（corneal stromal cells，CSCs）的影響及其作用機制，為角膜基質(zhì)損傷治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔（無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（南京維森特生物技術(shù)有限公司）；膠原酶（美國Invitrogen公司）；茜素紅檢測試劑盒（西安赫特生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）；Annexin V-FITC/PI試劑盒（中國貝博公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國thermo公司）；RIPA組織細胞快速裂解液（美國Solarbio公司）；Goat Anti-Rabbit（二抗，WB）和Alexa Fluor 488 conjugated Affinipure Goat（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；β-actin（一抗，WB）（美國Abcam公司）；本實驗其余所有抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；倒置拍照顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司）；熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；流式細胞儀（美國貝克頓-迪金森公司）；離心機（湖南湘儀公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；酶標儀（芬蘭雷勃公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔ADSCs的分離培養(yǎng)[12]無菌狀態(tài)下切取兔腹股溝皮下脂肪組織，用無鈣鎂磷酸鹽緩沖液（含雙抗）反復(fù)沖洗2～3次，再用眼科剪和眼科鑷除去脂肪組織膜和血管。PBS緩沖液沖洗3次，脂肪球置于平皿內(nèi)，眼科剪刀剪碎至糊狀，移入25cm2培養(yǎng)瓶，加入2倍體積的 0.1%Ⅰ型膠原酶。在37.5℃預(yù)熱的振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，190r/min消化30～35min。消化內(nèi)容物移入離心管，用等量的含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1 500r/min離心10min后棄去上清液。沉淀物用14ml含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重新懸浮，接種于2個75cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換一次培養(yǎng)基，以后1次/3d換液，7～9d后細胞生長融合達80%～90%，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2進行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 兔ADSCs的多向分化潛能 選取第3代兔ADSCs，以每孔1×105個細胞接種到置有蓋玻片的6孔板中，37℃，孵育24h。待細胞貼壁后，分別加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含有10%FBS、10-6M地塞米松、10mg/L胰島素、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和0.02mM吲哚美辛）、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含有10%FBS、10-6M地塞米松、10-2M β-甘油磷酸、50μg/ml抗壞血酸的高糖-DMEM培養(yǎng)基），并設(shè)立加入普通培養(yǎng)基的孔為空白組，2次/周換液，分別于培養(yǎng)2周和3周后進行油紅O及茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 兔CSCs的分離培養(yǎng) 無菌條件下摘取兔眼球，自角膜緣內(nèi)側(cè)1mm剪下全層組織片，D-Hank液沖洗2遍，顯微鏡下撕去角膜上皮層、前彈力層、后彈力層及內(nèi)皮層，將獲得的基質(zhì)片剪成碎塊，碎塊應(yīng)盡量小，加入1.5%Ⅱ型膠原酶消化液，37℃振蕩消化45min，見僅有少許組織塊剩余時，加入基質(zhì)細胞完全培養(yǎng)液終止消化，1 000r/min離心5min×2次，制成細胞懸液，采用20%FBS+DMEM/F12將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后換液，以后1次/2d換液。培養(yǎng)1周后待細胞融合達80%～90%后，胰蛋白酶消化，1 000r/min離心7min，棄上清液，按1∶2進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)時將胎牛血清濃度改為10%。

1.3.4 觀察兔CSCs及細胞鑒定 選取第2代細胞，制備密度為1×104/ml的細胞懸液，細胞接種，分別于培養(yǎng)3、5、7、9d觀察細胞形態(tài)，顯微鏡下拍照。采用免疫熒光方法檢測CSCs中波形蛋白及CK12蛋白表達情況。

1.3.5 兔ADSCs與兔CSCs體外間接共培養(yǎng) 實驗組（CSCs及ADSCs共培養(yǎng)）采用Transwell雙層非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)，將兔ADSCs接種在下室內(nèi)，兔CSCs接種于上室內(nèi)，上下層培養(yǎng)液以0.4μm聚碳酸酯膜相隔，進行體外共培養(yǎng)3d。將兔CSCs單獨培養(yǎng)作為對照組（單純CSCs）。

1.3.6 CCK-8法檢測細胞增殖情況 將兩組細胞接種于96孔板內(nèi)，每孔100μl，培養(yǎng)時間0、24、48、72、96、120h后，用CCK-8孵育2h左右，酶標儀測定各孔450nm下吸光度，并計算各組細胞增殖率。

1.3.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 兩組細胞分別用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞終止消化，1 500r/min離心5min，棄去上清液，收集細胞。用PBS重懸并洗滌細胞后，加入300μl含Ca2+的緩沖液懸浮細胞，并加入5μl的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15min，再加入10μl的PI染色，輕輕混勻細胞，于避光條件下室溫孵育10min，最后采用流式細胞儀檢測，采用Cell Quest軟件分析。

1.3.8 Western blot法檢測細胞金屬蛋白酶（MMPs）、膠原相關(guān)蛋白水平 將兩組細胞分別加入100μl的RIPA裂解液，放入4℃冰箱，10min，充分裂解后收集裂解液，并置于離心機，12 000r/min離心5min，取上清液待用。配制SDS-PAGE分離膠，分別取30μg蛋白量的細胞總蛋白樣品及maker加樣，將預(yù)先設(shè)計處理好的兩組樣本按順序加入上樣孔，電泳，轉(zhuǎn)膜后，將膜放入含5%脫脂奶粉封閉液，搖床振蕩1.5h。封閉結(jié)束后將膜放入含一抗稀釋液（β-actin、ALDH、MMP1、MMP2、MMP9稀釋比為1∶500，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原稀釋比為1∶400）的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。第2天取出，室溫振蕩30min，吸棄一抗，TBST洗10min×3次，再用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗（二抗稀釋比為1∶500），室溫搖床振蕩反應(yīng)1～2h，然后用 TBST洗膜。最后將膜置于配置好的化學發(fā)光試劑液中顯色，并使用FluorChen E型凝膠成像儀掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 兔ADSCs的形態(tài)觀察及分化潛能 兔ADSCs培養(yǎng)24h后可見少量散在的貼壁細胞，以長梭形細胞為主，部分呈三角形或不規(guī)則形。3d后可見較多的梭形貼壁細胞，生長速度快，后增生為形態(tài)相對均一穩(wěn)定的成纖維樣梭形細胞，7d后細胞融合至80%～90%。第3代ADSCs為長梭形，形態(tài)均一，增殖速度較快。ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后，可見細胞由長梭形變?yōu)闄E圓形，經(jīng)油紅O染色可見細胞內(nèi)大量紅色脂滴形成（圖1，見插頁）。ADSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，可見細胞呈多層生長，經(jīng)茜素紅染色可見細胞周圍基質(zhì)出現(xiàn)紅色鈣鹽沉積（圖2，見插頁）。

圖1 兔CSCs油紅O染色所見（a：空白組；b：成脂誘導(dǎo)組）

圖2 兔CSCs茜素紅染色（a：空白組；b：成骨誘導(dǎo)組）

2.2 兔CSCs的形態(tài)觀察及鑒定 體外培養(yǎng)中兔CSCs經(jīng)培養(yǎng)3d后，可見少量散在的貼壁細胞，多呈紡錘形，且生長較快，一般7～9d融合（圖3，見插頁），這表明角膜基質(zhì)細胞狀態(tài)良好，細胞活性高。細胞鑒定結(jié)果：兔CSCs胞質(zhì)中特異性表達的波形蛋白陽性表達率＞95%，CK12蛋白陽性表達率＜5%（圖4，見插頁），這表明CSCs分離后純度較高。

圖3 兔CSCs形態(tài)特點

圖4 兔CSCs免疫熒光檢測結(jié)果

2.3 CCK-8法檢測細胞增殖情況 從圖5可見，兩組細胞均隨著時間的增長，細胞增殖明顯。細胞培養(yǎng)24h后，實驗組較對照組細胞數(shù)顯著增高（P＜0.05）；細胞培養(yǎng)48h后，實驗組較對照組細胞數(shù)極其顯著增高（P＜0.01）；細胞培養(yǎng)72h后，實驗組較對照組細胞數(shù)極其顯著增高（P＜0.01）；細胞培養(yǎng)96h后，實驗組較對照組細胞數(shù)顯著增高（P＜0.05）；細胞培養(yǎng)120h后，實驗組較對照組細胞數(shù)顯著增高（P＜0.05）。這表明ADSCs可促進CSCs的增殖。

圖5 CCK-8法檢測細胞增殖情況

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 與對照組相比，實驗組兔ADSCs對兔CSCs的凋亡有抑制作用。實驗組通過共培養(yǎng)3d后，采用Annexin V-FITC試劑盒定量檢測細胞凋亡率，結(jié)果顯示對照組總凋亡率為7.81%，實驗組總凋亡率為4.86%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示實驗組細胞凋亡率較?。▓D6，見插頁）。這表明ADSCs抑制角膜基質(zhì)細胞的凋亡。

圖6 兩組細胞凋亡情況

2.5 Western blot法檢測MMPs、膠原相關(guān)蛋白水平 實驗組ALDH、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原表達均較對照組上調(diào)，MMP1、MMP2、MMP9蛋白表達均較對照組下調(diào)（圖7）。這表明ADSCs有效抑制MMPs表達，促進膠原相關(guān)蛋白表達。

3 討論

臨床上因角膜疾病致盲的患者比例較高，同種異體角膜移植手術(shù)是目前治療該類疾病的主要方式。但由于供體匱乏，加上術(shù)后免疫排斥發(fā)生率高，限制了其應(yīng)用。因此，尋求有效的治療角膜損傷的方法成為目前迫切需要解決的問題。利用種子細胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化或共培養(yǎng)為治療此類疾病提供了一個新的思路。自2001年Zuk等[1]發(fā)現(xiàn)ADSCs以來，ADSCs因其具有取材方便、獲取率高、對供區(qū)組織損傷小、體外擴增迅速以及多向分化潛能等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學中[4]。在分離培養(yǎng)兔ADSCs中，筆者取兔腹股溝區(qū)皮下脂肪組織，在取材時剔除血管及筋膜并用PBS反復(fù)沖洗，利用貼壁篩選法去除血細胞成分并分離出ADSCs。分離培養(yǎng)的ADSCs具有很好的增殖能力，與成脂及成骨誘導(dǎo)液作用后可向脂肪細胞及骨細胞分化，油紅O及茜素紅染色進一步證實了其多向分化的能力。

有研究表明，ADSCs在治療多種再生疾病方面有著重要作用[13-14]。最新一項研究表明ADSCs在一定誘導(dǎo)條件下，可分化為血管內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞，在血管再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。本研究主要觀察兔ADSCs對CSCs的可塑性。在兔ADSCs與兔CSCs共培養(yǎng)中，CSCs的形態(tài)上未發(fā)生明顯改變，在間接共培養(yǎng)72h后，通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)兔ADSCs顯著促進兔CSCs增殖，通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)兔ADSCs能抑制CSCs凋亡。這與Arnalich-Montiel等[16]研究發(fā)現(xiàn)的在兔角膜基質(zhì)缺損處注射人ADSCs懸液，ADSCs能存活在兔角膜基質(zhì)中12周以上并進行了基質(zhì)結(jié)構(gòu)的重建相類似。

圖7 兩組細胞MMPs、膠原相關(guān)蛋白表達情況

1962年Gross首次發(fā)現(xiàn)MMPs，它是一類重要的蛋白酶，在細胞外基質(zhì)的降解過程中起關(guān)鍵作用。在已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的MMPs家族中共有五大類，其中第一類為膠原酶（包括MMP1），他們的主要水解底物是纖維類膠原，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原；第二類為明膠酶（包括MMP2、MMP9），他們的主要水解底物是變性膠原及基膜的主要成分Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原等；第三類為基質(zhì)水解酶類（MMP3和MMP10），水解底物比較廣泛，如Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原、明膠、蛋白聚糖以及糖蛋白等；第四類及第五類分別為膜型基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)溶解酶[17]。本研究發(fā)現(xiàn)實驗組MMP1、MMP2、MMP3蛋白表達較對照組下降，而Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原表達均上調(diào)，這表明ADSCs有效抑制MMPs表達，促進膠原相關(guān)蛋白表達。角膜主要由角膜上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層及內(nèi)皮細胞層組成，其中基質(zhì)層占了90%。CSCs靜息狀態(tài)下呈紡錘形，且CD14及ALDH表達陽性[18]。膠原纖維特定排序及ALDH的均勻分布維持了角膜的透明性[19]，有研究發(fā)現(xiàn)外傷后角膜透明度的減少與基質(zhì)層ALDH表達減少相關(guān)[20]。本研究實驗組ALDH蛋白表達較對照組明顯增加，提示兔ADSCs在維持兔角膜基質(zhì)層透明度可能有一定作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)兔ADSCs可以促進CSCs增殖、抑制其凋亡，促進細胞外基質(zhì)的合成，在角膜基質(zhì)損傷治療中具有較好的應(yīng)用前景，這為后期角膜基質(zhì)損傷治療動物實驗研究提供一定依據(jù)。

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Effect of rabbit adipose-derived stem cell on proliferation and apoptosis of corneal stromal cells

Objective To investigate the effects of rabbit adipose-derived stem cells(ADSCs)on proliferation and apoptosis of rabbit corneal stromal cells(CSCs)．MethodsADSCs were isolated from subcutaneous adipose tissue in groin area of New Zealand white rabbit with the method of collagenase type I digestion．The isolated ADSCs were cultured and passed to 3 generation and its differentiation ability was evaluated．CSCs were obtained from the corneas of New Zealand rabbits with the method of collagenase II digestion．After initial expansion,the CSCs were cultured up to passage 2 and then prepared for experiment．The CSCs were cultured alone(control group)or co-cultured with ADSCs(indirect co-culture group)．After incubation for 72 h the proliferative capacity of CSCs was evaluated by CCK-8 assay,apoptosis of CSCs was determined by flow cytometry, the expression of matrix metalloproteinases(MMPs)and collagens was detected by Western blot,and the invasion activity of corneal stromal cells was also examined in vitro． Results Compared with the control group,ADSCs significantly promoted proliferation and invasion of CSCs in indirect co-culture group(P＜0．05)．The group with ADSCs showed low percentage of apoptotic cells．CSCs secreted lower levels of MMPs and higher levels of collagens in indirect co-culture group． Conclusion ADSCs can promote plasticity and EMC synthesis of corneal stromal cells,and suppress the apoptosis at the same time．It suggests that application of ADSCs may be a promising approach for corneal injury therapy．

Adipose-derived stem cells Corneal stromal cells Injury Proliferation Matrix metalloproteinases

2016-09-08）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.5.2016-1361

浙江省科技廳重大專項（2013C03048-1）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院、杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院眼科（鄭青青、沈婷）；溫州醫(yī)科大學眼視光學院（沈江、李秋實、洪朝陽）；浙江省立同德醫(yī)院眼科（李文偉）

李文偉，E-mail：wenwei60306@163.com