楊愛華 李秀梅 韓文瑜

(1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林長春 130062; 2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,天津 300402)

單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立

楊愛華1，2李秀梅2韓文瑜1

(1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林長春 130062; 2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,天津 300402)

研究針對(duì)細(xì)胞增生性李斯特菌（以下簡稱單增李斯特菌）hlyA基因設(shè)計(jì)了4條特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了單增李斯特菌的LAMP快速檢測(cè)方法。特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能夠特異地檢測(cè)單增李斯特菌，其最低檢測(cè)限為3 CFU/mL。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳、顯色反應(yīng)進(jìn)行判定。LAMP可以快速、直觀、準(zhǔn)確地檢測(cè)單增李斯特菌，是一種適合基層現(xiàn)場應(yīng)用的檢測(cè)方法。

單增李斯特菌 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 快速檢測(cè) hlyA基因

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種重要的人畜共患病原菌和食源性病原菌，人畜在食用了被該菌污染的食物后，除了出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛等一般細(xì)菌性食物中毒癥狀外，還會(huì)導(dǎo)致腦膜炎、骨髓炎、敗血癥、心肌炎、流產(chǎn)等，病死率高達(dá)30%。該菌在自然界分布廣泛，4℃的環(huán)境中仍可生長、繁殖，增加了冷藏食品威脅人類健康的風(fēng)險(xiǎn)，WHO已將該菌列為重點(diǎn)檢測(cè)的食源性致病菌之一，因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)保證人類和動(dòng)物生命安全具有重要意義。

目前，用于單增李斯特菌的檢測(cè)技術(shù)主要有細(xì)菌分離鑒定、免疫學(xué)方法和PCR等，但上述方法花費(fèi)時(shí)間較長，而且判定結(jié)果需要借助精密儀器設(shè)備，難以在基層生產(chǎn)中普及應(yīng)用，因此建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的病原診斷方法顯得十分必要。Notomi等于2000年發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴4條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列。本試驗(yàn)針對(duì)單增李斯特菌的hlyA基因設(shè)計(jì)了一套LAMP特異性引物，建立了一種用于單增李斯特菌基因檢測(cè)的方法。與傳統(tǒng)PCR相比，該方法操作簡便，實(shí)驗(yàn)儀器要求較低，在普通恒溫水浴鍋中反應(yīng)45min即可完成，而且可以通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果，能快速、準(zhǔn)確地鑒定單增李斯特菌，在基層生產(chǎn)中具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 材料

Bst DNA聚合酶、dNTP、10×buffer（Mg2+Free）緩沖液購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；Betaine Solution（甜菜堿）、鈣黃綠素購自美國Sigma公司，MgCl2、DNA marker購自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購自杭州博日股份科技有限公司；單增李斯特菌菌株（54003，2013.11.22）由CDC惠贈(zèng)；金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌菌株購自廣州粵晨生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 4.0（http：//primerexlorer.jp；Eiken Chemical Co.Ltd，Japan），針對(duì)單增李斯特菌保守的hlyA基因設(shè)計(jì)了4條LAMP的特異性引物，包括2條外引物（F3和B3）以及2條內(nèi)引物（FIP和BIP）。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 單增李斯特菌DNA模板的提取

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)單增李斯特菌細(xì)菌培養(yǎng)液提取基因組DNA，經(jīng)核酸蛋白定量儀定量后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單增李斯特菌LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)體系的建立

根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，依次對(duì)引物濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，具體梯度如下：內(nèi)、外引物濃度比分別為：4、6、8、10，外引物終濃度為0.2μmol·L-1，其對(duì)應(yīng)的內(nèi)引物終濃度分別為：0.8、1.2、1.6、2.0μmol·L-1；Mg2+終濃度分別為2、3、4、6、8、10 mmol·L-1；甜菜堿終濃度分別為：0.4、0.6、0.8、1.0mmol·L-1；反應(yīng)溫度分別為61、62、63、64、65℃；在25μL的反應(yīng)體系中dNTP混合液終濃度為1.4 mmol·L-1，1×buffer（Mg2+free），Bst DNA聚合酶8 U，模板2μl。所有體系在63℃分別反應(yīng)45 min，80℃加熱2 min終止反應(yīng)，取5μl反應(yīng)產(chǎn)物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定最佳的反應(yīng)體系。

1.5 單增李斯特菌LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定

1.5.1 電泳分析與測(cè)序鑒定

將含LAMP反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管置于水浴鍋中63℃等溫?cái)U(kuò)增45min后，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠分析和測(cè)序驗(yàn)證。

1.5.2 可視化鑒定

反應(yīng)前在LAMP反應(yīng)液中加入1μl的熒光染料鈣黃綠素，LAMP反應(yīng)結(jié)束后用肉眼直接觀察LAMP反應(yīng)液的顏色變化。反應(yīng)液顏色呈現(xiàn)綠色為陽性，反應(yīng)液顏色呈現(xiàn)橘紅色為陰性。

1.6 LAMP的敏感性試驗(yàn)

將單增李斯特菌細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)后進(jìn)行10倍梯度稀釋，用建立的LAMP檢測(cè)方法分別對(duì)各稀釋度單增李斯特菌菌液DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定檢測(cè)方法的敏感性。

1.7 LAMP的特異性試驗(yàn)

將單增李斯特菌與金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌菌株基因組核酸，按照建立的LAMP檢測(cè)方法，進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 LAMP 檢測(cè)方法反應(yīng)條件的建立

優(yōu)化后的反應(yīng)體系（2 5 μ l）確定為：外引物（F 3和B3）（5pmol·μl-1）各0.5μl，內(nèi)引物（FIP和BIP）（40pmol·μl-1）各0.5μL，Mg2+（25mM）6μl，甜菜堿（5M）4μl，dNTP混合液（10mM）3.5μl，10×buffer（Mg2+free）2.5μl，Bst DNA聚合酶（8 U·μl-1）1μl，模板2μl，去離子水3μl，鈣黃綠素1μl。最佳反應(yīng)溫度為63℃。

2.2 LAMP產(chǎn)物的電泳與測(cè)序分析結(jié)果

將提取的單增李斯特菌DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，取5μl反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1，單增李斯特菌DNA擴(kuò)增出了梯狀條帶，而陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，表明建立的LAMP檢測(cè)方法可以用于單增李斯特菌核酸的檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果分析表明，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段與單增李斯特菌（GENBANK：HM589603.1）的同源性達(dá)到99.92%，證明LAMP產(chǎn)物為單增李斯特菌基因片段。

圖1 單增李斯特菌LAMP產(chǎn)物電泳圖

2.3 LAMP產(chǎn)物的可視化鑒定結(jié)果

在LAMP反應(yīng)前加入熒光染料鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)束后通過肉眼觀察，陽性樣品管呈綠色，而對(duì)照陰性管橘紅色，見圖2。其結(jié)果與LAMP產(chǎn)物電泳結(jié)果一致，表明加入鈣黃綠素后所呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)具有特異性。

圖2 單增李斯特菌LAMP可視化結(jié)果

2.4 LAMP敏感性試驗(yàn)

單增李斯特菌細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)后，原始菌濃度為3×106CFU/ml，10倍梯度稀釋菌液后，分別提取DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖3。圖中3 CFU/mL以上的稀釋度均顯示了典型的LAMP擴(kuò)增條帶，且信號(hào)依次遞增。說明該方法的靈敏度理論上可達(dá)到大約3 CFU/ml的水平。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

LAMP特異性試驗(yàn)

將單增李斯特菌與金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌菌株的基因組DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果見圖4。該結(jié)果表明，只有單增李斯特菌的DNA出現(xiàn)目的條帶，其他均未擴(kuò)增出任何條帶。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

從本試驗(yàn)可以看出，LAMP 擴(kuò)增方法具有普通PCR 無法比擬的優(yōu)點(diǎn)：（1）只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)。（2）高特異性。原理上LAMP法擴(kuò)增的特異性很高，因此可以根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否，即能夠進(jìn)行細(xì)菌或病毒的定性檢測(cè)。（3）快速、高效擴(kuò)增。整個(gè)擴(kuò)增大約1 h 即可完成。（4）靈敏度高：擴(kuò)增模板可達(dá)約3 CFU/ml。（5）步驟簡單。反應(yīng)不需PCR 儀和特殊試劑，在水浴鍋中就能進(jìn)行。（6）鑒定簡便。LAMP 擴(kuò)增過程中，核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物—焦磷酸鎂沉淀，使陽性反應(yīng)管有明顯的變渾濁現(xiàn)象，肉眼即可直接觀察結(jié)果。但在本試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生這種沉淀的重復(fù)性不高且量很小，其靈敏度也低于瓊脂糖凝膠電泳分析法，這也是今后需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。同時(shí)大量的擴(kuò)增產(chǎn)物在結(jié)合核酸染色劑鈣黃綠素的情況下，有肉眼可見的顏色變化（陰性為橙黃色，陽性偏綠色），結(jié)果肉眼可視。

保證引物的特異性是LAMP方法建立的關(guān)鍵。因此，選擇特異的保守基因作為靶基因，用來設(shè)計(jì)合適的引物至關(guān)重要。本研究選擇的靶基因是在李斯特菌屬種間有很高同源性，并且是單增李斯特菌最主要的致病因子的hlyA基因。利用該設(shè)計(jì)引物，經(jīng)Blastn和Clustal W比對(duì)分析，在理論上保證其特異性并位于hlyA基因保守區(qū)段，再經(jīng)對(duì)實(shí)際菌株樣品檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明，本研究建立的LAMP快速檢測(cè)方法能特異性的檢測(cè)和鑒定單增李斯特菌，與金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌無交叉反應(yīng)，具有很高的特異性，能夠有效地避免假陽性問題。

為了提高檢測(cè)效率，縮短檢測(cè)周期，本研究建立了檢測(cè)單增李斯特菌的LAMP檢測(cè)方法。結(jié)果顯示該方法是一種快速、實(shí)用、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，如果進(jìn)一步優(yōu)化、完善和推廣，該技術(shù)將會(huì)在單增李斯特菌的早期診斷及預(yù)防控制方面發(fā)揮重要作用。

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楊愛華（1981-），女，獸醫(yī)師，本科學(xué)歷，主要從事動(dòng)物疫病防控及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。

韓文瑜（1955-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)椴≡⑸飳W(xué)與免疫學(xué)。