劉志剛，聶玉芝，劉琴

沙苑子對運動大鼠海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝的調(diào)控作用

劉志剛1，聶玉芝2，劉琴1

目的：研究沙苑子對運動大鼠海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝的影響。方法：SD大鼠隨機分為安靜對照組（Contrnl group，C組）、一般訓(xùn)練對照組（training control group，TC組）、強化訓(xùn)練組（intensive training group，IT組）和強化訓(xùn)練沙苑子干預(yù)組（SAC intervention and intensive training group，SACIT組）。第8周始取材，分離大鼠海馬組織，處理后用自動氨基酸分析儀進行測試。各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以S-N-K檢驗并計算效應(yīng)量Cohen’s d值。結(jié)果：谷氨酸（Glu）：與C組相比，其他3組極顯著升高（P＜0.01），與TC組相比，IT組顯著升高（P＜0.05）。天冬氨酸（Asp）：與C組相比，其他3組極顯著降低（P＜0.01），與TC組相比，IT組和SACIT組極顯著降低（P＜0.01）。γ-氨基丁酸（GABA）：IT組比其他3組極顯著升高（P＜0.01），TC組比C組和SACIT組極顯著升高（P＜0.01），SACIT組比C組極顯著升高（P＜0.01）。甘氨酸（Gly）：C組和SACIT組比IT組極顯著降低（P＜0.01），TC組和SACIT組比C組極顯著升高（P＜0.01），SACIT組比TC組顯著降低（P＜0.05）。脯氨酸（Pro）：IT組比C組顯著升高（P＜0.05），比TC組極顯著升高（P＜0.01）。Glu/GABA比值：TC組比C組顯著降低（P＜0.05），IT組比C組極顯著降低（P＜0.01），SACIT組比TC組和IT組顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論：沙苑子能顯著提高運動大鼠海馬Glu和Asp含量而降低GABA、Gly和Pro水平，提高Glu/GABA比值，使大鼠海馬整體興奮性上升，有效對抗運動性中樞抑制和中樞疲勞。

沙苑子；海馬；氨基酸；神經(jīng)遞質(zhì)

沙苑子（semen astragali complanati，SAC）是中國特有的豆科黃芪屬植物扁莖黃芪（astragatus complanatus）的種子。扁莖黃芪分布于中國大陸的東北、華北、四川、陜西、江蘇、甘肅、寧夏、河南等地，生長于海拔1 000～1 700 m的地區(qū)。中醫(yī)認為，沙苑子可以溫補肝腎，有固精、縮尿的功效［4］。化學(xué)分析表明，沙苑子含有氨基酸、黃酮類、三萜類等多種生物活性物質(zhì)，具有保肝、增強免疫和抗疲勞等作用［1，3］。研究表明，腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝失衡是導(dǎo)致運動性中樞疲勞的重要因素［6］。不同強度的運動對海馬神經(jīng)元電生理活動可產(chǎn)生不同影響，運動疲勞可顯著改變大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的誘發(fā)和自發(fā)電活動，抑制神經(jīng)元的興奮性，可引起大鼠海馬出現(xiàn)長時程抑制（long-term depression，LTD），并因此降低其學(xué)習和記憶能力［5］。本實驗通過檢測運動大鼠海馬部位氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝變化，研究沙苑子對運動大鼠中樞疲勞的影響和對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選用SPF級（specific pathogen free）SD（Sprague Dawley）雄性健康大鼠48只，3月齡，體重220±20 g。由陜西中醫(yī)藥研究所動物飼養(yǎng)中心提供（動物合格證編號：陜醫(yī)動字第08-005），國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。環(huán)境溫度20℃～25℃，相對濕度40%～60%，噪聲不大于50 dB，自然光照明。沙苑子采用商品藥物顆粒制劑，輔料為蔗糖、糊精（輔料僅起填充、粘合和賦形作用，成分配比為：60%沙苑子浸膏∶蔗糖∶糊精=1∶3∶3，干燥后制成商品顆粒），由陜西省恒心堂制藥有限公司提供。

1.2 主要儀器

德國Hettich MIKRO 22R冷凍離心機；天津泰斯特DK-98-1A恒溫水浴鍋；德國Sartorius BP-310S電子天平；杭州段氏DSPT-202型大鼠跑臺；上海申安LDZX-30KBS高壓滅菌鍋；廣東科龍BCD-272電冰箱；德國Eppendorf微量移液器；美國Beckman 121B氨基酸自動分析儀；日立U-3900紫外分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

大鼠隨機分為4組，每組12只：安靜對照組（Control group，C組），不進行任何訓(xùn)練；一般訓(xùn)練對照組（training control group，TC組），5周適應(yīng)訓(xùn)練后再進行2周一般訓(xùn)練；強化訓(xùn)練組（intensive training group，IT組），5周適應(yīng)訓(xùn)練后再進行2周強化訓(xùn)練；強化訓(xùn)練沙苑子干預(yù)組（SAC intervention and intensive training group，SACIT組），5周適應(yīng)訓(xùn)練后再進行2周強化訓(xùn)練，同時灌胃沙苑子制劑。

1.3.2 運動模型

采用Benford運動模型稍加改動。適應(yīng)實驗環(huán)境1～2天后開始訓(xùn)練，以遞增強度的方式在跑臺上運動，跑臺水平放置，零坡度。訓(xùn)練時間固定在每天18：00～18：30之間。從訓(xùn)練第1周起，每周遞增速度，分別為15 m/min、22 m/min、27 m/min、31 m/min、35 m/min。每次訓(xùn)練20 min，每周5天，共訓(xùn)練5周。第5周后按以下方案進行訓(xùn)練：

一般訓(xùn)練：第6、7周（每周7天）實驗動物以35 m/min速度，在零坡度跑臺上訓(xùn)練20 min。

強化訓(xùn)練：第6、7周（每周7天）實驗動物以35 m/min速度，在零坡度跑臺上訓(xùn)練30 min。

造模共7周，于第8周始取材。

1.3.3 給藥方案

按照實驗動物與人用藥量的換算關(guān)系以及參考文獻［10］，確定SACIT組大鼠每日固定的時間（9：00～9：30）按1.8 g/kg的給藥劑量，以2 mL生理鹽水溶解后經(jīng)口腔灌胃。其余組喂服等量生理鹽水，每天1次。

1.3.4 取材和測試

實驗動物按照運動方案完成全部訓(xùn)練后，于第8周始按照SACIT組、IT組、TC組、C組的順序依次取材：大鼠用乙醚麻醉，離斷頸椎處死，開顱取出完整大腦，分離大腦海馬區(qū)域。以預(yù)冷的生理鹽水沖洗殘余血液，濾紙吸干。以天平精密稱量海馬重量后研磨，組織勻漿用80%乙醇提取30 min后過濾，濾液以75℃水浴蒸干，再用pH=2.2檸檬酸緩沖液和10%偏磷酸按1∶1的比例溶解。離心取上清，在氨基酸自動分析儀上進行測試。

測定條件：1）層析柱：2.8 mm×300 mm；2）樹脂床高度：185 mm；3）分析時間：65 min；4）緩沖液流速：10 mL/h；5）茚三酮流速：5 mL/h；6）緩沖液壓力：4 826～5 515 kPa；7）緩沖液pH值：pH 3.28、pH 3.90、pH 5.20；8）層析柱溫度：53℃；9）反應(yīng)水浴溫度：100℃；10）進樣量：50μL；11）再生液：0.2 mol/L NaOH。

2 實驗結(jié)果

由表1可知，谷氨酸（Glu）：與C組相比，其他3組極顯著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.67、0.81、0.77），與TC組相比，IT組顯著升高（P＜0.05，Cohen’s d=0.53）；天冬氨酸（Asp）：與C組相比，其他3組極顯著降低（P＜0.01，Cohen’s d=0.82、0.91、0.90），與TC組相比，IT組和SACIT組極顯著降低（P＜0.01，Cohen’s d=0.76、0.71）；γ-氨基丁酸（GABA）：IT組比C組、TC組和SACIT組極顯著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.88、0.39、0.78），TC組比C組和SACIT組極顯著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.87、0.69），SACIT組比C組極顯著升高（P＜0.01,Cohen’s d=0.88）；甘氨酸（Gly）：C組和IT組比SACIT組極顯著降低（P＜0.01，Cohen’s d= 0.90、0.61），TC組和SACIT組比C組極顯著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.89、0.57），SACIT組比TC組顯著降低（P＜0.05，Cohen’s d=0.42）；脯氨酸（Pro）：IT組比C組顯著升高（P＜0.05，Cohen’s d=0.45），比TC組極顯著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.60）；Glu/GABA比值：TC組和IT組比C組顯著降低（P＜0.05，Cohen’s d=0.56）和極顯著降低（P＜0.01，Cohen’s d=0.58），SACIT組比TC組和IT組顯著升高（P＜0.05，Cohen’s d=0.43、0.47）。

表1 各組大鼠海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的變化（±SD，mg/100g）Table 1 Changes of Amino Acid Neurotransmitters in the Rat Hippocampus of Each Group

注：經(jīng)單因素方差分析和S-N-K檢驗，與C組相比，?表示P＜0.05，?表示P＜0.01；與TC組相比，?表示P＜0.05，?表示P＜0.01；與IT組相比，?表示P＜0.05，?表示P＜0.01；與SACIT組相比，?表示P＜0.05，?表示P＜0.01。EAA表示興奮性氨基酸；IAA表示抑制性氨基酸。

SACIT組61.92±2.54?31.53±2.01??24.05±0.76??7.35±1.31??9.08±1.17 2.61±0.67??谷氨酸（EAA）天冬氨酸（EAA）γ-氨基丁酸(IAA)甘氨酸（IAA）脯氨酸（IAA）Glu/GABA比值C組52.56±4.85 43.16±3.53 19.41±1.72 5.76±0.63 8.45±1.56 2.75±0.58 TC組59.79±2.88?35.33±1.73?29.08±3.67??8.33±0.70??7.75±1.20 2.10±0.36?IT組63.07±2.32??30.52±2.33??32.71±4.83??8.91±0.88?10.28±2.08??1.96±0.54?

按照Cohen的標準［14,18］，d值越大t檢驗的結(jié)果越可靠。通常把d值小于0.2時認為具有很小的效應(yīng)量，即t檢驗結(jié)果可靠性較低；而d值在0.5附近具有中等效應(yīng)量；d值大于0.8時具有大的效應(yīng)量，即t檢驗結(jié)果具有比較大的可靠性。

3 討論

眾多研究顯示，氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)參與介導(dǎo)了運動疲勞導(dǎo)致的海馬興奮性變化。本實驗結(jié)果顯示，運動訓(xùn)練使大鼠海馬回氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝增強，Glu/GABA比值降低，且運動強度越大，降低的越明顯。對實驗數(shù)據(jù)的分析表明，沙苑子可以顯著對抗由運動誘導(dǎo)的大鼠海馬Glu/ GABA比值下降和由此導(dǎo)致的中樞興奮性減弱。

運動導(dǎo)致大鼠海馬Glu/GABA比值降低，使大鼠海馬神經(jīng)元突觸后抑制增強，興奮性下降，可發(fā)展為中樞疲勞。而Glu脫羧生成GABA，GABA可最終氧化成琥珀酸（圖1）。作為最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，運動中GABA在大腦中堆積的主要原因是由于谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）活性增高，而γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA transaminase，GABA-T）與琥珀酸半醛脫氫酶（succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH）活性下降，導(dǎo)致GABA在中樞堆積（圖1）。聶玉芝［8］研究認為，GABA氧化減弱是導(dǎo)致GABA在腦中堆積的主要原因，并發(fā)現(xiàn)沙苑子下調(diào)GAD基因表達的同時上調(diào)了GABA-T和SSADH的基因表達，在減少GABA生成的同時加速了其氧化，從而減少了GABA在腦中的堆積。

本研究中，與C組相比，另外3組大鼠海馬Asp均顯著降低。降低的幅度依次為：IT組＞SACIT組＞TC組，且IT組與SACIT組顯著低于TC組。說明，運動可以導(dǎo)致大鼠海馬Asp含量下降，且運動強度越大，下降越明顯。而沙苑子干預(yù)后，SACIT組大鼠海馬Asp含量高于IT組，但無統(tǒng)計學(xué)差異。由于Asp難以通過血腦屏障，所以一般都是通過轉(zhuǎn)化成天冬酰胺的形式出入大腦。作為一種興奮性氨基酸遞質(zhì)，大鼠海馬Asp含量隨著運動中樞疲勞的發(fā)展而逐步減少，說明海馬回作為支配運動技能形成的中樞結(jié)構(gòu)和記憶環(huán)路，其興奮性開始下降。而運動技能正是以記憶為基礎(chǔ)形成的。海馬記憶環(huán)路是以海馬回作為起始和終了的神經(jīng)沖動傳導(dǎo)路線：海馬→穹窿→下丘腦乳頭體→丘腦前核→扣帶回→海馬，其中任何一個環(huán)節(jié)受到阻斷都會導(dǎo)致短期記憶受損，出現(xiàn)動作技能不協(xié)調(diào)、變形、動作吃力、能耗增加等外周疲勞現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，沙苑子干預(yù)后大鼠海馬Asp下降的趨勢有所遏制。提示，沙苑子可能對運動大鼠海馬Asp代謝存在一定正性影響。

圖1 中樞氨基酸遞質(zhì)代謝關(guān)系示意圖Figure 1.The Metabolic Pathway of Amino Acid Neurotransmitter in the Brain

Gly屬于抑制性氨基酸。本研究結(jié)果顯示，Gly在各組大鼠海馬含量依次為：IT組＞TC組＞SACIT組＞C組，表明，Gly在大鼠海馬中的水平隨著運動強度的提升而增加。經(jīng)沙苑子干預(yù)后，SACIT組大鼠Gly水平極顯著低于未經(jīng)藥物干預(yù)的IT組，也顯著低于未經(jīng)藥物干預(yù)的低強度運動組TC組。由于Gly不能通過血腦屏障，所以，海馬中的Gly都由局部神經(jīng)元合成和代謝，受循環(huán)中氨基酸的影響極小。提示，沙苑子能夠顯著抑制運動中大鼠海馬Gly水平的上升，延緩其抑制過程和運動性中樞疲勞的發(fā)展。

各組大鼠Pro水平在各組變化情況為：IT組＞SACIT組＞C組＞TC組，但只有IT組相對于C組和TC組出現(xiàn)了顯著性升高。有關(guān)Pro作為神經(jīng)遞質(zhì)的資料較少，但有證據(jù)認為，Pro也屬于一種抑制性中樞神經(jīng)遞質(zhì)，腦室注射Pro可導(dǎo)致小鼠學(xué)習能力下降和逆行性記憶喪失［13］。海馬神經(jīng)元突觸中存在大量NMDA（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體，是LTP（long-term potentiation，LTP）產(chǎn)生的主要因素。Pro可以通過阻斷Glu釋放拮抗其產(chǎn)生的LTP效應(yīng)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與C組相比，低強度運動大鼠海馬Pro水平略呈下降趨勢，但無顯著性差別，而大強度運動則導(dǎo)致大鼠海馬Pro顯著升高，經(jīng)沙苑子干預(yù)后出現(xiàn)了降低趨勢，但同樣無顯著性差異。Pro由Glu生成，所以，Glu不僅是GABA的前體，也是Pro的前體。根據(jù)運動性疲勞的“自我保護”學(xué)說，具有興奮性的Glu在運動中代謝為抑制性的GABA和Pro，加強了中樞抑制并發(fā)展為運動性中樞疲勞，避免機體在運動中產(chǎn)生過度“損耗”，是一種負反饋調(diào)節(jié)，可以看做是機體在運動中產(chǎn)生的一種自我保護。

本研究的前期工作也發(fā)現(xiàn)［7,15,16］，力竭訓(xùn)練使大鼠血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）和尿素氮（blood usea nitrogen，BUN）顯著升高，嚴重損害其肝腎功能。沙苑子對運動訓(xùn)練大鼠海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控作用可能與它補益肝腎的功能有關(guān)。中醫(yī)認為，腎主骨、藏精、生髓，是“側(cè)力”產(chǎn)生的重要源泉，肝主疏泄，若疏泄失調(diào)則可導(dǎo)致身體機能下降，促使疲勞出現(xiàn)［12］。黃崇剛等［2］用沙苑子干預(yù)醋酸棉酚和環(huán)磷酰胺所致的大鼠生精障礙模型后發(fā)現(xiàn)，沙苑子提取物能明顯增加大鼠的精子數(shù)和精子活動率降低畸形率并提高其精囊腺指數(shù)，顯著提高腎陽虛模型小鼠的體溫及其自發(fā)活動次數(shù)，延長小鼠在低溫環(huán)境中游泳的存活時間并增加其睪丸指數(shù)。這與沙苑子“補腎”“固精”的作用相符。孫利兵等［9］的研究證實，沙苑子黃酮對四氯化碳所致的小鼠肝損傷有明顯的保護和抗脂質(zhì)過氧化作用，說明沙苑子有護肝作用。王文心［11］的研究認為，沙苑子可以明顯改善抑郁癥小鼠的抑郁狀態(tài)，有明顯的抗抑郁作用。而抑郁癥與大腦突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)代謝失調(diào)密切相關(guān)。

4 結(jié)論

1.沙苑子能顯著提高運動大鼠海馬Glu和Asp含量而降低GABA、Gly和Pro水平，提高Glu/GABA比值，使大鼠海馬整體興奮性上升，有效對抗大強度運動產(chǎn)生的中樞抑制和中樞疲勞。

2.沙苑子還作用于海馬回相關(guān)基因，降低GAD活性的同時升高GABA-T和SSADH酶活性，進而改變Glu/GABA比值的平衡狀態(tài)，提升運動大鼠海馬的興奮性。

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Study on the Regulatory Effects of Semen Astragali Complanati on the Amino Acid Neurotransmitters in the Gyri Hippocampi of Exercise Rats

LIU Zhi-gang1，NIE Yu-zhi2，LIU Qin1

Objective：To study the regulatory effects of semen astragali complanati（SAC）on the amino acid neurotransmitters in the gyri hippocampi of exercised rats.Methods：SD rats randomly divided into 4 groups：a control group（C group）；training control group（TC group）；intensive training group（IT group）；SAC intervention and intensive training group（SACIT group）.The rat’s hippocampal tissue was isolated after 7 weeks training.The tissue homogenate was prepared and extracted with 80%ethanol.The centrifugal supernatant was used to test by automatic amino acid analyzer.All data of each group are test by S-N-K of one way ANOVA.Results：Glu：compared with C group，Glu increase significantly in other three groups（P＜0.01），compared with TC group，Glu increase significantly in IT group（P＜0.05）.Asp：compared with C group，Asp significantly decrease in other three groups（P＜0.01），compared with TC group，Asp significantly decrease both in IT group and SACIT group（P＜0.01）.GABA：IT group are significantly higher than the other three groups（P＜0.01），TC group are significantly higher than C group and SACIT group（P＜0.01），SACIT group are significantly higher than C group（P＜0.01）.Gly：The C group and SACIT group are significantly lower than IT group（P＜0.01），TC group and SACIT group are significantly higher than C group（P＜0.01），SACIT group are significantly lower than TC group（P＜0.05）.Pro：IT group are significantly higher than C group（P＜0.05）and TC group（P＜0.01）. Glu/GABA：TC group and IT group are significantly lower than C group（P＜0.05），SACIT group are higher than both TC group and IT group（P＜0.05，P＜0.05）.Conclusions：SAC can significantly increase Glu，Asp and Glu/GABA ratio while decrease GABA，Gly and Pro in the gyri hippocampi of exercised rats.SAC can improve the excitability of the gyri hippocampi and show an effect against the exercise-induced central fatigue.

semen astragali complanati；gyri hippocampi；amino acid；neurotransmitter

1002-9826（2017）02-0134-05

10.16470/j.csst.201702018

G804.7

：A

2016-05-04；

：2016-09-23

國家自然科學(xué)基金資助項目（地區(qū)科學(xué)基金項目51568066）。

劉志剛，男，講師，碩士，主要研究方向為運動生化與營養(yǎng)，E-mail：xbaili@126.com。

1.玉溪師范學(xué)院，云南 玉溪653100；2.北京市第 66中學(xué)，北京100053

1.Yuxi Normal University，Yuxi 653100，China；2.Beijing No.66 Middle School，Beijing 100053，China.