袁翼　李土建　顧得月　熊妍妍　劉雪珠　李鵬

摘要：實(shí)驗(yàn)室條件下，在28 d周期內(nèi)研究了不同濃度（0、0.05、0.15、0.45、1.35 mg/L）的含油廢水對(duì)海水中微生物數(shù)量和酶活性的影響。結(jié)果表明，海水中的微生物數(shù)量隨著含油廢水污染時(shí)間和濃度的不同，表現(xiàn)出不同的變化特征。在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)菌數(shù)目在7 d時(shí)達(dá)到最大值，之后開(kāi)始呈緩慢下降的趨勢(shì)，其中7 d時(shí)含油濃度為0.15 mg/L的處理數(shù)量增長(zhǎng)最為明顯；在培養(yǎng)過(guò)程中放線菌一直保持增長(zhǎng)的趨勢(shì)，濃度為0.45 mg/L的處理在28 d時(shí)放線菌數(shù)量明顯超過(guò)其他濃度處理；在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中霉菌與酵母菌數(shù)量極少。含油廢水對(duì)海水中微生物脫氫酶和超氧化物歧化酶（SOD）的誘導(dǎo)作用不同。微生物的脫氫酶活性在0～14 d內(nèi)緩慢上升，至14 d時(shí)達(dá)到最大，其后隨著時(shí)間推移脫氫酶活性逐漸減弱。而SOD酶活性在28 d的培養(yǎng)期內(nèi)呈先下降后回升并緩慢升高的趨勢(shì)，且不同濃度的含油廢水油污染對(duì)海水中微生物SOD酶活性的影響差異不顯著（P>0.05）。

關(guān)鍵詞：含油廢水；微生物數(shù)量；酶活性

中圖分類(lèi)號(hào)：X55；Q938.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：0439-8114（2017）04-0645-05

目前國(guó)內(nèi)開(kāi)展的關(guān)于溢油污染對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)影響的研究主要集中在貝類(lèi)、無(wú)脊椎動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)以及海鳥(niǎo)和哺乳動(dòng)物等方面[1，2]。也有大量研究集中在海洋細(xì)菌對(duì)海洋溢油污染物的生物降解上，如石油降解菌的分離、純化和篩選、石油降解菌的降解效率以及海洋石油污染的生物修復(fù)等方面[3-5]，很少涉及石油污染對(duì)海洋微生物消長(zhǎng)規(guī)律及微生物酶活性的影響[6]。

造船產(chǎn)業(yè)是國(guó)民經(jīng)濟(jì)中的重要組成部分。船廠在對(duì)船舶進(jìn)行機(jī)械加工、部件預(yù)舾裝、碼頭舾裝、試驗(yàn)和試航時(shí)產(chǎn)生的廢水中含有較高濃度的油，含油廢水被排到海水中后，油層覆蓋了水面，阻止空氣中的氧向水中擴(kuò)散。由于水體中溶解氧減少，藻類(lèi)的光合作用受到了限制。同時(shí)，廢水中的油除了刺激烴降解微生物的生長(zhǎng)外，還會(huì)引起油污染海域微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)組成和微生物酶活性等方面的變化，并最終影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的次級(jí)生產(chǎn)過(guò)程[7，8]。

本研究以舟山某造船廠廢油為試驗(yàn)用油，遠(yuǎn)離造船廠近海表層水為試驗(yàn)用水。于實(shí)驗(yàn)室條件下，研究含油海水與海水中微生物數(shù)量對(duì)應(yīng)關(guān)系及其對(duì)酶活性的影響，為初步建立含油廢水污染對(duì)海洋次級(jí)生產(chǎn)過(guò)程影響的評(píng)估體系奠定基礎(chǔ)，并為油污染海域自身修復(fù)能力和含油廢水污染治理提供科學(xué)依據(jù)和決策參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)海水采自遠(yuǎn)離造船廠近海表層海水，樣品采集參照《海洋生物生態(tài)調(diào)查技術(shù)規(guī)程》方法[9]。

試驗(yàn)用油為舟山某造船廠廢油。由于油難溶于水，為使油均勻分散到海水中，首先制備飽和含油海水（母液），用于研究重油在水相中穩(wěn)定存在的小油珠和溶解成分對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌的影響。母液制備方法：在無(wú)菌海水（0.22 μm濾膜過(guò)濾）中滴加過(guò)量試驗(yàn)用油，將混合液置于磁力攪拌機(jī)上，連續(xù)攪拌24 h后靜置約6 h，用分液漏斗分離出下層水相即為飽和的含油海水（母液）。

1.2 方法

1.2.1 母液濃度測(cè)定 采用紫外分光光度法測(cè)定[10]：①油標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 000 mg/L），準(zhǔn)備稱(chēng)取100 mg標(biāo)準(zhǔn)油于燒杯中，加入少量石油醚，溶解。全量轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，并稀釋至標(biāo)線，混勻。②油標(biāo)準(zhǔn)使用液（50 mg/L），移取5 mL油標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL容量瓶中，用石油醚稀釋至標(biāo)線，混勻。

分別配制10、20、30、40、50 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，用1 cm光程石英比色皿以石油醚為空白參比，在256 nm波長(zhǎng)處依次測(cè)定上述樣品的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.001 0x-0.000 2，R2=0.998 7。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出母液濃度為22.5 mg/L；根據(jù)母液測(cè)定結(jié)果及海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置處理濃度為0、0.05、0.15、0.45、1.35 mg/L，并按20 mg/L和10 mg/L加入NH4NO3和KH2PO4作為無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽[11]，每個(gè)濃度分裝100 mL水樣于250 mL錐形瓶中。將設(shè)置好的5個(gè)濃度組置于28 ℃、120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、7、14、21、28 d進(jìn)行取樣測(cè)定。

1.2.2 海水初始狀態(tài)下微生物數(shù)量檢測(cè) 采用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法檢測(cè)海水初始狀態(tài)下的微生物總數(shù)[12-14]：①取一張0.2 μm微孔濾膜，使膜光滑面朝上平貼于濾器底部；②搖勻樣品，吸取0.25 mL菌液注入濾器內(nèi)，同時(shí)加入0.375 mL無(wú)菌沖洗水，加2～3滴丫啶橙染液染色3 min，手動(dòng)抽濾染色液，使微生物留于濾膜上，用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再將濾液抽干；③取下濾器，用鑷子將濾膜移到載玻片上，滴一小滴香波油，在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)；④觀察并計(jì)數(shù)3個(gè)裝片共30個(gè)視野下微生物數(shù)目，并按下列公式計(jì)算初始狀態(tài)下海水中微生物總數(shù)：E=X■·V，式中，E表示樣品中微生物數(shù)量（ind/mL）；X表示各視野中細(xì)菌總數(shù)的平均值（個(gè)）；S1表示濾膜面積（mm2）；S2表示顯微鏡視野面積（mm2）；V表示過(guò)濾菌液體積（mL）。

1.2.3 可培養(yǎng)異養(yǎng)微生物計(jì)數(shù) 可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)測(cè)定方法用Zobell 2216E培養(yǎng)基稀釋平板法培養(yǎng)并計(jì)數(shù)[15]，可培養(yǎng)異養(yǎng)放線菌數(shù)測(cè)定方法用高氏一號(hào)培養(yǎng)基稀釋平板法培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，可培養(yǎng)異養(yǎng)霉菌及酵母菌數(shù)測(cè)定方法用PDA培養(yǎng)基稀釋平板法培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。

1.2.4 脫氫酶及SOD酶活性測(cè)定 脫氫酶活性測(cè)定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[16，17]，其原理是無(wú)色的TTC在細(xì)胞呼吸過(guò)程中替代O2-作為人為受氫體，接受H+后被還原成紅色的三苯基甲臜（TF），通過(guò)測(cè)定TF吸光值大小反映細(xì)胞活力大小，樣品前處理采用文獻(xiàn)[18]方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用改良的鄰苯三酚自氧化法（325 nm法），細(xì)胞破壁采用助溶劑破壁法[19，20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)分析在SPSS 17.0中進(jìn)行，采用方差分析和LSD比較不同廢油濃度、不同培養(yǎng)時(shí)間微生物數(shù)量及生物酶活性的差異性。相關(guān)圖表制作通過(guò)Excel 2010完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水初始狀態(tài)下微生物數(shù)量的檢測(cè)

為檢測(cè)海水初始狀態(tài)下微生物總數(shù)，通過(guò)觀察熒光顯微鏡下30個(gè)不同視野，得X=16個(gè)，S1=491 mm2，S2=7.2×10-3 mm2，V=0.25 mL，數(shù)據(jù)代入公式，可得E=4.36×106 ind/mL[21]，觀察結(jié)果如圖1所示。由于經(jīng)熒光染色后在觀察時(shí)肉眼無(wú)法分辨死細(xì)胞及無(wú)生命顆粒，故正常情況下計(jì)算所得數(shù)值往往較實(shí)際可培養(yǎng)異養(yǎng)微生物總數(shù)高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.2 不同濃度含油廢水對(duì)海水中細(xì)菌數(shù)量的影響

不同含油濃度條件下海水中細(xì)菌的數(shù)量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，在培養(yǎng)過(guò)程中不同的培養(yǎng)時(shí)間所有處理細(xì)菌數(shù)目均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在最初培養(yǎng)的7 d內(nèi)各組均大幅度增長(zhǎng)，而以含油濃度為0.15 mg/L的處理數(shù)量增長(zhǎng)速度最快。各組均于7 d時(shí)細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最大值，且可測(cè)得的各處理細(xì)菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。其原因可能是石油進(jìn)入海水一段時(shí)間后，刺激能夠利用石油烴作為C源并參與石油烴降解細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其大量增殖，而石油污染對(duì)細(xì)菌生存的影響存在一個(gè)最適濃度。

而在7～14 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，各組細(xì)菌數(shù)量均呈明顯下降趨勢(shì)，表明長(zhǎng)時(shí)間的含油環(huán)境對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有抑制作用。之后各組均緩慢上升，至28 d時(shí)，數(shù)值達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，各組之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05），且各處理數(shù)值均高于對(duì)照。其中，最高濃度（1.35 mg/L）海水中的細(xì)菌數(shù)在14～21 d時(shí)曾下降至無(wú)，可能是由于高濃度的溢油污染對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，之后又逐漸上升，至28 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，其數(shù)值較對(duì)照組明顯上升，但低于其他濃度組，推測(cè)是由于某些細(xì)菌對(duì)石油烴的降解作用所致。

已有研究表明，環(huán)境中可培養(yǎng)石油降解菌數(shù)與石油濃度呈密切正相關(guān)[22，23]。李博等[22]的研究表明，在石油污染的海水中，可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量先是呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在第7天時(shí)達(dá)到最大值，然后逐漸減少。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，石油污染后，可培養(yǎng)異養(yǎng)菌數(shù)短期內(nèi)先增長(zhǎng)后降低，較長(zhǎng)時(shí)間后，逐漸恢復(fù)。另有研究表明，細(xì)菌中的多個(gè)屬的菌類(lèi)對(duì)石油烴具有不同程度的降解能力[24-26]。

2.3 不同濃度含油廢水對(duì)海水中放線菌數(shù)量的影響

在培養(yǎng)過(guò)程中放線菌的數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖3所示，放線菌數(shù)量一直保持增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且在21 d及21 d之前處理與對(duì)照放線菌數(shù)量無(wú)顯著性差異（P>0.05），含油濃度為0.45 mg/L的處理在28 d時(shí)放線菌數(shù)量顯著高于其他處理（P<0.05），故推測(cè)放線菌比細(xì)菌耐受性更好，可適應(yīng)更高濃度的石油污染。而經(jīng)用PDA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)表明所取海水中霉菌與酵母菌數(shù)量極少。

對(duì)于放線菌類(lèi)而言，在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中處理放線菌數(shù)總體呈上升趨勢(shì)，而且隨著時(shí)間推移，含油濃度越高（在低于1.35 mg/L時(shí)），這種趨勢(shì)越明顯。這也證明了放線菌對(duì)石油烴類(lèi)具有強(qiáng)大的降解作用[27-32]，但到目前為止，針對(duì)放線菌與石油污染及其對(duì)石油降解的應(yīng)用研究還很少，值得進(jìn)一步探索。

2.4 不同濃度含油廢水對(duì)海水微生物脫氫酶活性的影響

在海水中加入不同濃度的含油廢水后，海水中微生物脫氫酶活性隨時(shí)間變化特征如圖4所示。在0～7 d內(nèi)各處理微生物脫氫酶活性緩慢上升，脫氫酶活性顯著高于對(duì)照（P<0.05）。推測(cè)石油污染物誘導(dǎo)了細(xì)菌脫氫酶的產(chǎn)生。7～14 d內(nèi)，除含油濃度為0.05 mg/L的處理大幅度升高，顯著高于其他處理（P<0.05），脫氫酶活性達(dá)到最大值外，其余0.15、0.45、1.35 mg/L濃度處理組，均呈小幅度下降趨勢(shì)，其后隨著時(shí)間推移，14～28 d試驗(yàn)過(guò)程中脫氫酶活性逐漸減小，除28 d時(shí)濃度為0.05 mg/L的處理脫氫酶活性高于對(duì)照外，其余處理均小于對(duì)照。推測(cè)不同濃度的含油廢水對(duì)脫氫酶誘導(dǎo)的作用程度不同，高濃度的含油廢水反而較快抑制了脫氫酶的活性。

脫氫酶是微生物體內(nèi)參與石油烴類(lèi)氧化分解的重要酶類(lèi)，脫氫是石油降解或轉(zhuǎn)化的首要步驟。已有研究表明脫氫酶與石油烴降解有良好的相關(guān)性[33，34]，通常能反映微生物對(duì)石油污染的適應(yīng)情況。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，各處理脫氫酶活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，且7 d后含油濃度為0.05 mg/L的處理脫氫酶活性明顯高于其他處理。推測(cè)石油污染發(fā)生后，有關(guān)石油降解菌增殖，從而導(dǎo)致與石油降解有關(guān)的菌株脫氫酶活性增強(qiáng)，且較低濃度的含油廢水能更好地誘導(dǎo)油降解菌產(chǎn)生大量脫氫酶，使得脫氫酶活性顯著升高。之后，隨著石油被逐步降解，脫氫酶活性也緩慢降低到穩(wěn)定水平。

2.5 不同濃度含油廢水對(duì)海水微生物SOD酶活性的影響

在海水中加入不同濃度的含油廢水后，海水中微生物SOD酶活性隨時(shí)間變化特征如圖5所示。在28 d的培養(yǎng)期內(nèi)各處理SOD酶活性呈先下降后回升并持續(xù)緩慢升高的趨勢(shì)，0～7 d內(nèi)不同濃度的含油廢水對(duì)海水中微生物SOD酶活性的影響差異不顯著（P>0.05），只有濃度為0.05 mg/L的處理SOD酶活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)；而在7～14 d內(nèi)，各個(gè)處理SOD酶活性下降程度不大；隨后SOD酶活性至21 d時(shí)稍有上升，至試驗(yàn)結(jié)束各處理SOD酶活性已保持相對(duì)穩(wěn)定。

不考慮偶然因素，可以推測(cè)微生物對(duì)海水中施加的重油污染成分需要較長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)期，并在適應(yīng)期過(guò)后，重油可以刺激并誘導(dǎo)微生物SOD酶的生物合成。但從培養(yǎng)后期SOD酶活性升高的趨勢(shì)來(lái)看，這種誘導(dǎo)作用是十分微弱的。目前為止，國(guó)內(nèi)外有諸多關(guān)于石油污染物對(duì)海洋生物抗氧化酶系統(tǒng)毒性效應(yīng)的研究[33-36]，但較少見(jiàn)石油污染對(duì)海洋微生物SOD酶活性的研究。SOD酶是生物抗氧化系統(tǒng)的重要酶類(lèi)，其活性對(duì)維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)具有重要意義。與脫氫酶相比，重油污染對(duì)SOD酶的促進(jìn)作用要小很多，在所設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi)，僅在14 d時(shí)有小幅回落而后緩慢上升。Christian等[37]在原油污染對(duì)大鼠抗氧化酶的作用中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給原油超過(guò)6 mL/kg時(shí)其SOD酶活性明顯上升，而在給原油3 mL/kg時(shí)其SOD酶活性變化不明顯。

3 小結(jié)

1）被含油廢水污染后，海水中可培養(yǎng)異養(yǎng)微生物數(shù)目（細(xì)菌及放線菌）隨時(shí)間推移和含油濃度的不同而變化。從28 d周期來(lái)看，可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)目總體呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，7 d時(shí)各處理細(xì)菌數(shù)量大幅度上升，其中以0.15 mg/L濃度處理增長(zhǎng)最為迅速，7 d后細(xì)菌數(shù)量明顯下降，至試驗(yàn)結(jié)束各處理數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定。本試驗(yàn)中0.15 mg/L濃度的含油廢水對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有較明顯的促進(jìn)作用，而超過(guò)或低于該濃度其促進(jìn)作用減弱?？傮w顯示含油廢水污染發(fā)生后，細(xì)菌對(duì)其的自?xún)裟芰κ怯邢薜摹?/p>

長(zhǎng)期培養(yǎng)放線菌的過(guò)程中，放線菌數(shù)量一直保持上升趨勢(shì)。7 d之前放線菌基數(shù)極小，至7 d時(shí)各處理放線菌數(shù)量開(kāi)始逐步上升。此外，放線菌數(shù)量14 d后出現(xiàn)快速增長(zhǎng)，其在含油廢水污染環(huán)境中的耐受力比細(xì)菌更好，但其對(duì)廢油的適應(yīng)能力及降解修復(fù)能力值得進(jìn)一步研究。

2）較低濃度（本試驗(yàn)中0.15 mg/L）的含油廢水可促進(jìn)海水中可培養(yǎng)異養(yǎng)微生物脫氫酶的大量合成，且含油濃度為0.15 mg/L時(shí)，這種促進(jìn)作用最為明顯。但從21 d開(kāi)始至試驗(yàn)結(jié)束，各組脫氫酶活性均維持在較低水平，且對(duì)照與各處理間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。顯然，在0.05～1.35 mg/L濃度范圍內(nèi)和0～14 d時(shí)間內(nèi)，含油廢水對(duì)脫氫酶具有誘導(dǎo)作用，但一旦濃度過(guò)高或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則其誘導(dǎo)作用就不明顯并開(kāi)始減弱。相較于SOD酶，脫氫酶對(duì)含有廢水的刺激更為敏感，是否可將脫氫酶活性作為檢測(cè)海洋受廢油早期污染的一個(gè)生理檢測(cè)指標(biāo)值得研究。

相比脫氫酶，各組濃度的含油廢水對(duì)海水中微生物SOD酶活性的影響差異性不顯著（P>0.05）。在所有設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi)各組SOD酶活在14 d時(shí)有小幅下降現(xiàn)象，21 d至試驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照與各處理SOD酶活性亦無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明含油廢水污染對(duì)海水微生物SOD酶活性的影響較小。SOD酶對(duì)海洋廢油的這種遲鈍反應(yīng)是否可以作為檢測(cè)海洋受重度廢油污染的一個(gè)生理檢測(cè)指標(biāo)有待于進(jìn)一步研究。

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