張文雋，吳亞召，雷 萍**，姜 娟，楊新文，杜 芳

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.洛川縣農業(yè)機械技術服務中心，陜西 洛川 727400；3.陜西省蘋果研究發(fā)展中心，陜西 西安 710043）

桑黃黃酮液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化*

張文雋1，吳亞召1，雷 萍1**，姜 娟2，楊新文3，杜 芳1

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.洛川縣農業(yè)機械技術服務中心，陜西 洛川 727400；3.陜西省蘋果研究發(fā)展中心，陜西 西安 710043）

采用搖瓶培養(yǎng)方法，通過單因素試驗研究發(fā)酵培養(yǎng)液初始pH值、裝液量、接種量和搖床轉速對桑黃（Phellinus linteus)發(fā)酵胞內黃酮產量的影響，結果表明，最適初始pH為6.5，裝液量為100 mL/300mL，接種量為10%，搖床轉速為150 r·min-1。在單因素試驗的基礎上采用L9(34)正交試驗優(yōu)化桑黃黃酮發(fā)酵培養(yǎng)條件，最佳工藝為：發(fā)酵液初始pH6.5，300 mL三角瓶裝液量為100 mL，種子液接種量為10%，搖床轉速150 r·min-1。

桑黃；胞內黃酮；液體發(fā)酵；培養(yǎng)條件

桑黃屬擔子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱（Hymenomycetes） 多孔菌目（Polyphorales） 多層孔菌科（Hymenochaeyaceae）針層孔菌屬（Phellinus），是多年生的珍稀藥用真菌[1]，因其生長于桑樹上而得名。據《藥性論》記載，桑黃味微苦，性寒，在我國傳統(tǒng)中藥中用于治療血淋、血崩、帶下、閉經、臍腹?jié)础⒚摳匦寡?、盜汗、痢疾等癥[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)桑黃具有抗腫瘤、抗氧化、抗纖維化、抗菌、降血脂等功效[3]，是國際公認抗癌效果最佳的真菌之一。

桑黃主要活性成分為多糖、黃酮、三萜類等[4]。大量研究表明桑黃中的黃酮類物質，具有很好的抗氧化效果，可有效清除DPPF自由基，抑制脂質的過氧化[5]。但由于近年來對桑黃的無序采集，野生資源日益減少，再加上受其生理生態(tài)特殊性和環(huán)境條件的制約，人工栽培難度較大，無法獲得大量子實體以滿足市場需求。有研究表明，桑黃菌絲體活性成分與子實體接近，且菌絲體提取物同樣具有抗氧化、抗腫瘤等功效[6]。因此，可以采用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術獲得桑黃菌絲體和代謝產物，以滿足生物醫(yī)藥市場需求。本項研究通過單因素和四因素三水平正交試驗，以桑黃菌絲體和胞內黃酮為指標優(yōu)化桑黃黃酮發(fā)酵培養(yǎng)條件，以期為大規(guī)模生產桑黃黃酮類活性物質提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

桑黃菌種來自于陜西省微生物研究所微生物資源中心第三研究室，經分子鑒定為裂蹄木層孔菌（Phellinus linteus）[7]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 一級種培養(yǎng)基

采用綜合PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖 2%、蛋白胨 0.4%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、VB110 mg/100mL，pH自然。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉1%、葡萄糖2%、黃豆粉1%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、VB110 mg/100mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 一級種制備

按綜合PDA培養(yǎng)基配方配制，高壓滅菌后制斜面，無菌條件下接種桑黃菌菌種塊0.3 cm2，28℃條件下恒溫培養(yǎng)至長滿斜面，得一級菌種備用。

1.3.2 種子液制備

按種子培養(yǎng)基配方配制，定容后采用300 mL三角瓶分裝，裝液量為100 mL，接種活化后的桑黃斜面菌種0.5 cm2，搖床轉速150 r·min-1，28℃培養(yǎng)4 d。

1.3.3 初始pH值篩選

按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉調節(jié)培養(yǎng)基pH到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。裝液量100 mL/300mL，種子液接種量10%，置往復式搖床，搖床轉速150 r·min-1，28℃培養(yǎng)6 d。

1.3.4 裝液量篩選

按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制，pH自然。采用300 mL三角瓶分別裝液50 mL、80 mL、100 mL、120 mL、150 mL，種子液接種量10%，置往復式搖床，搖床轉速150 r·min-1，28℃培養(yǎng)6 d。

1.3.5 接種量篩選

按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制，pH自然。采用300 mL三角瓶裝液100 mL，種子液接種量分別為6%、8%、10%、12%、15%，置往復式搖床，搖床轉速150 r·min-1，28℃培養(yǎng)6 d。

1.3.6 搖床轉速篩選

按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制，pH自然。采用300 mL三角瓶裝液 100mL，種子液接種量分別為10%，置往復式搖床，搖床轉速100 r·min-1、120 r·min-1、150 r·min-1、180 r·min-1、210 r·min-1，28℃培養(yǎng)6 d。

1.3.7 正交優(yōu)化

在單因素篩選的基礎上，采用四因素三水平正交試驗的方法對桑黃黃酮液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。每次試驗重復3次，結果取平均值。試驗因素及其各水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素和水平Tab.1 Factors and their levels in L9(34)orthogonal test

1.3.8 菌絲體生物量測定

發(fā)酵結束后將發(fā)酵液用4層紗布過濾，菌絲體用蒸餾水沖洗3次～5次，于68℃烘干至恒重，稱量。

1.3.9 黃酮產量測定

準確稱取桑黃菌粉0.5 g，加入15 mL濃度為60%的乙醇，70℃恒溫水浴提取2 h，流水冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，過濾。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法，以蘆丁為標準品測定黃酮含量[8]，并計算黃酮產量（黃酮含量乘以菌絲體產量除以1 000）。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用Excel進行統(tǒng)計分析，多組比較，新復極差檢驗法。

2 結果與分析

2.1 初始pH值篩選試驗

不同初始pH值對桑黃黃酮發(fā)酵的影響見表2。

培養(yǎng)液pH值的高低直接影響菌絲體生長和代謝產物的生成，通常真菌喜歡在偏酸性環(huán)境下生長，而桑黃生長對pH具有較廣的適應性。由表2可以看出，不同初始pH對桑黃菌絲體和胞內黃酮的影響具有明顯差異，對桑黃菌絲體生物量的影響依次為pH6.5＞pH6.0＞pH5.5＞pH5.0＞pH7.0＞pH7.5，對胞內黃酮的影響依次為pH6.5＞pH6.0＞pH7.0＞pH5.5＞pH7.5＞pH5.0。因此，桑黃菌絲體和胞內黃酮形成的最適pH為6.5，此時菌絲體生物量最大為14.60 g·L-1，胞內黃酮產量最大16.26 mg/100mL。

表2 不同初始pH值對桑黃黃酮發(fā)酵的影響Tab.2 Effect of various initial pH on Phellinus linteus fermentation

2.2 裝液量篩選試驗

不同裝液量對桑黃黃酮發(fā)酵的影響見表3。

表3 不同裝液量對桑黃黃酮發(fā)酵的影響Tab.3 Effect of various loading volume on Phellinus linteus fermentation

桑黃發(fā)酵過程中需要充足的氧氣，溶解氧的供應水平直接影響菌絲體生長和代謝產物的合成，裝液量是發(fā)酵溶氧的一個間接指標。搖瓶發(fā)酵時裝液量越少，傳氧系數(shù)越大，但發(fā)酵過程中溶液容易蒸發(fā)，造成營養(yǎng)不足；裝液量越多，傳氧系數(shù)小，培養(yǎng)基中溶解氧也越少，菌絲體和代謝產物產量減少。由表3可以看出，不同裝液量對桑黃菌絲體和胞內黃酮產量影響差異明顯，對桑黃菌絲體生物量的影響依次為100 mL＞120 mL＞150 mL＞80 mL＞50 mL，對胞內黃酮的影響依次為100 mL＞120 mL＞80 mL＞150 mL＞50 mL。因此，桑黃菌絲體和胞內黃酮形成的最適裝液量為100 mL/300mL，此時菌絲體生物量最大13.77 g·L-1，胞內黃酮產量最大16.19 mg/ 100mL。

2.3 接種量篩選試驗

不同接種量對桑黃黃酮發(fā)酵的影響見表4。

表4 不同接種量對桑黃黃酮發(fā)酵的影響Tab.4 Effect of various inoculum dose on Phellinus linteus fermentation

接種量的大小決定生產菌種在發(fā)酵液中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大會引起溶氧不足，影響產物合成；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵生產率。由表4可以看出不同接種量對桑黃菌絲體和胞內黃酮產量影響有差異，對桑黃菌絲體生物量的影響依次為10%＞8%＞12%＞6%＞15%，對胞內黃酮的影響依次為10%＞8%＞12%＞15%＞6%。因此，桑黃菌絲體和胞內黃酮形成的最適接種量為10%，此時菌絲體生物量最大14.12 g·L-1，胞內黃酮產量最大16.35 mg/100mL。

2.4 搖床轉速篩選試驗

不同搖床轉速對桑黃黃酮發(fā)酵的影響見表5。

搖床轉速不僅影響菌絲體生長，而且影響代謝產物的合成。轉速太低，培養(yǎng)液的溶氧率不能滿足菌絲體生長和代謝產物生成的需求，轉速太高，培養(yǎng)液的通氣得到了改善，但過高的震蕩速率會產生一定的剪切作用，不利于菌絲和代謝產物的積累。由表5可以看出，不同搖床轉速對桑黃菌絲體和胞內黃酮形成的影響差異明顯，對桑黃菌絲體生物量的影響依次為180 r·min-1＞150 r·min-1＞120 r·min-1＞210 r·min-1＞100 r·min-1，對胞內黃酮的影響依次為150 r·min-1＞180 r·min-1＞120 r·min-1＞210 r·min-1＞100 r·min-1。因此，以桑黃菌胞內黃酮為目標產物時，最適搖床轉速為150 r·min-1，產量為15.26 mg/100mL；以菌絲體為目標產物時，最適搖床轉速為180 r·min-1，菌絲體生物量最大13.97 g·L-1。

表5 不同搖床轉速對桑黃黃酮發(fā)酵的影響Tab.5 Effect of various shaking speed on Phellinus linteus fermentation

2.5 正交試驗優(yōu)化結果與直觀分析

L9(34)正交試驗結果直觀分析表見表6。

從表6可以看出各因素對桑黃胞內黃酮產量的影響依次為D＞A＞B＞C，正交試驗各因素的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2，即優(yōu)化后的桑黃黃酮液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH6.5，300 mL三角瓶裝液量為100 mL，種子液接種量為10%，搖床轉速150 r·min-1。

3 討論

通過單因素篩選試驗發(fā)現(xiàn)，桑黃胞內黃酮液體發(fā)酵最適初始pH為6.5，其次為6.0；最適裝液量為100 mL/300mL，其次為120 mL/300mL；最適接種量為10%，其次為8%；最適搖床轉速為150 r·min-1，其次為180 r·min-1。采用L9(34)正交試驗進一步優(yōu)化后獲得桑黃胞內黃酮最適培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH6.5，300 mL三角瓶裝液量為100 mL，種子液接種量為10%，搖床轉速150 r·min-1。

表6 L9(34)正交試驗結果直觀分析表Tab.6 Intuitive analysis table for the result of L9(34)orthogonal test

[1]劉波.中國藥用真菌[M].太原：山西人民出版社，1974：71-73.

[2]江蘇新醫(yī)藥學院.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版社，1995.

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[4]鄭立軍，王清，季俊虬，等.藥用真菌桑黃的研究進展[J].現(xiàn)代中藥研究與實驗，2005，19（3）：60-64.

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[7]張文雋，吳亞召，雷萍，等.秦巴山區(qū)野生桑黃rDNA ITS序列及親緣關系分析[J].中國食用菌,2015，34（1）：50-52.

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Optimization of Culture Conditions for Fermenting Flavones from Phellinus linteus

ZHANG Wen-jun1,WU Ya-zhao1,LEI Ping1,JIANG Juan2,YANG Xin-wen3,DU Fang1
(1.Shaanxi Microbioogy Research Institute,Xi’an 710043,China;2.Luochuan Agicultural Machinery Technical Service Center, Luochuan 727400,China；3.Shaanxi Center of Researching and Developing Apple,Xi’an 710043,China)

Effect of initial pH value of fermentation broth,loading volume,inoculum dose and shaking speed on the yield of intracellular flavone in liquid culture of Phellinus linteus were studied by single factor experiment using shake-flask culture method.The result demonstrated that the optimum initial pH value was 6.5,the optimum loading volume was 100 mL/300mL, the optimum inoculum dose was 10%and the optimum shaking speed was 150 r·min-1.The fermentation condition of intracellular flavone was optimized by using L9(34)orthogonal test on the basis of single factor experiment,and the optimum process was initial pH of 6.5,loading volume of 100 mL/300mL,inoculum dose of 10%and shaking speed of 150 r·min-1.

Phellinus linteus;intracellular flavones;liquid fermentation;culture condition

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0052-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.014

陜西省科學院應用基礎與產業(yè)化項目（2014K-14）。

張文雋（1977-），女，本科，助理研究員，主要從事食（藥）用菌資源開發(fā)利用研究。E-mail:562758960@qq.com

**通信作者：雷萍（1966-），女，本科，副研究員，主要從事食（藥）用菌資源開發(fā)利用研究。E-mail:wuleiping2529@126.com

2017-01-28