馬艷佳，李 瑞，賈 寧，胡曉剛，王躍穎，田環(huán)環(huán)，曹昺焱，張淑靜

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029)

實驗研究

電針對2型糖尿病大鼠糖代謝及血清SOD、MDA含量的影響*

馬艷佳，李 瑞△，賈 寧，胡曉剛，王躍穎，田環(huán)環(huán)，曹昺焱，張淑靜

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029)

目的:觀察電針胃脘下俞與后三里對2型糖尿病(T2DM)大鼠糖代謝和氧化應(yīng)激的影響，探討電針改善T2DM的可能作用機制。方法:雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、胃脘下俞組、后三里組和格列美脲組，每組8只。造模方法為高糖高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ) 35 mg/kg一次性腹腔注射。電針(2 Hz、2 mA)干預(yù)，每次留針20 min，6次/周，共4周。測量大鼠體質(zhì)量及空腹血糖;采用放射性免疫法檢測大鼠血清中空腹胰島素(FINS)水平、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)水平，并于干預(yù)前后進(jìn)行口服糖耐量試驗(OGTT);計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及胰島B細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-B)。結(jié)果:電針“胃脘下俞”及“后三里”能在1～2周左右顯著降低模型動物血糖。通過電針干預(yù)均在一定程度上降低T2DM大鼠的空腹胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)，且胃脘下俞組最優(yōu)(P＜0.01)。與空白組比較，模型組大鼠的空腹血糖和血清MDA含量均升高，SOD含量均降低(P＜0.05);與模型組比較，胃脘下俞組、后三里組SOD含量均升高(P＜0.05)，MDA含量均降低(P＜0.05)，而格列美脲組SOD、MDA含量與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論:電針胃脘下俞穴和后三里對T2DM大鼠均具有一定的降糖作用，并可能通過整體上改善其氧化應(yīng)激狀態(tài)來改善胰島素抵抗，進(jìn)而達(dá)到干預(yù)T2DM的作用。

電針;2型糖尿病;糖代謝;氧化應(yīng)激

糖尿病(Diabetes)是因機體胰島素分泌相對或絕對不足導(dǎo)致慢性高血糖的一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病［1-2］。其發(fā)病率高、致殘率高，其中 2型糖尿病(T2DM)占80%以上［3］。胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是T2DM的主要發(fā)病機制［4］。

針刺療法是一種安全有效的治療方法，近年來對針刺治療T2DM的研究亦頗有成果。研究發(fā)現(xiàn)針刺可以通過降低T2DM患者的胰島素、瘦素水平，提高血清脂聯(lián)素水平，從而減輕IR，調(diào)節(jié)糖、脂代謝和內(nèi)分泌功能紊亂，治療T2DM［5-6］。亦有研究發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠有炎癥因子表達(dá)，并且IR程度很可能與炎癥因子表達(dá)的多少密切相關(guān)［7］。此外，針刺可顯著降低胰島素抵抗模型大鼠的空腹血糖、血漿胰島素、血清C-肽水平，使其胰島素敏感性指數(shù)顯著升高。說明針刺可有效逆轉(zhuǎn)大鼠的IR狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)針刺可能在基因轉(zhuǎn)錄水平對胰島素受體底物1(IRS1)、胰島素受體底物2 (IRS2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)產(chǎn)生影響，從而改善磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］。

而氧化應(yīng)激(Oxidative stress，OS)對胰島素信號傳導(dǎo)通路中的多個元件都有負(fù)面作用，可以直接及間接激活細(xì)胞內(nèi)的一系列應(yīng)激信號通路，如核因子(NF-Kb)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、蛋白激酶C (PKC)、p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等，從而阻斷胰島素作用通路，導(dǎo)致胰島素抵抗［9］?？梢奣2DM不僅存在IR，亦與OS損傷關(guān)系密切。本研究從對內(nèi)分泌、糖代謝功能的總體調(diào)節(jié)與OS方面評估電針治療T2DM的作用。

1 實驗方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量160 g左右，清潔級，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司［SCXK (京)2011-004］。適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周，全部動物于18℃～25℃室溫，空氣流通，相對濕度55% ～70%，12 h晝夜循環(huán)光照的普通級實驗室中進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間動物自由飲食水。其中制備模型的動物在適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，改吃高糖高脂飼料(70%普通飼料、10%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉)，其余動物進(jìn)食普通飼料［北京華阜康生物科技股份有限公司，SCXK (京)2014-0008］。動物處置遵循中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(STZ，Sigma，s0130～500 mg)，格列美脲(Glimepiride，Sigma，250 mg)，均購自北京信德科興科學(xué)器材有限責(zé)任公司;中研太和牌針灸針(購自北京中研太和有限公司，LOT:031426);一次性使用無菌注射器(上海治宇醫(yī)療器械有限公司，批號20140715);血糖試紙(LOT24623833);羅氏血糖儀(ACCU-CHEK ACTIVE，Ser.No.GC05966832，LOT10113495);采血針(購自天津華鴻科技有限公司，LOT01-140804);電針儀(常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司，KWD-808);灌胃針;計時器;一次性手套、口罩;自制鼠套等等。

1.3 模型建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，測體質(zhì)量、空腹血糖，隨機選8只作為空白組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)。其余動物以高糖高脂飼料喂養(yǎng)50天后，按35 mg/kg質(zhì)量比腹腔注射2%STZ溶液(溶液配制:0.1 mol/L檸檬酸緩沖液和0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液按1.3∶1的比例混勻，按20 mg/ml的質(zhì)量體積比加入STZ粉末)，并繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。所有制備模型動物在造模3天后測隨機血糖，并在2周后測口服葡萄糖耐量(OGTT)實驗。以造模后第3天隨機血糖＞16.7 mmol/L，且OGTT2h后血糖＞11.1 mmol/L或第4天空腹血糖＞11.1 mmol/L且OGTT2h后血糖＞11.1 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 動物分組及干預(yù)

所有成模動物隨機分為模型組、模型+電針胃脘下俞組(簡稱胃脘下俞組)、模型+電針后三里組(簡稱后三里組)、格列美脲組，每組8只。干預(yù)均于每日18:00進(jìn)行，1周6次，共干預(yù)4周。實驗中胃脘下俞穴和后三里穴定位參考自《針灸學(xué)》［10］。定位如下:“胃脘下俞”穴位于大鼠第8胸椎下兩旁約5 mm，足三里穴位于后肢膝關(guān)節(jié)外下方當(dāng)腓骨小頭下5 mm處。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 空腹血糖 所有動物于干預(yù)前及干預(yù)第7、14、21、28、35、42天尾尖取血，以羅氏血糖儀檢測空腹血糖。

1.5.2 血清指標(biāo) 所有動物于首次干預(yù)前一晚及末次干預(yù)結(jié)束當(dāng)晚22:00禁食，次日早8:00目內(nèi)眥取血，4℃條件下3000轉(zhuǎn)/min，15 min離心取血清，放免法測各組大鼠血清中FINS水平、SOD、MDA含量水平。

1.5.3 模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及B細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-B) 以空腹血糖和空腹胰島素指標(biāo)進(jìn)行計算。HOMA-IR=空腹胰島素×空腹血糖÷22.5。HOMA-B=(空腹胰島素×20)÷(空腹血糖-3.5)

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間比較若各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且滿足方差齊性時采用單因素方差分析;進(jìn)一步的組間兩兩比較用LSD法;檢驗若不符合正態(tài)分布或方差不齊時采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖比較

由表1可見，針刺前各治療組大鼠空腹血糖與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。針刺1周后針刺組(胃脘下俞組與后三里組)大鼠空腹血糖與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且呈降低趨勢，而格列美脲組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。針刺2周后各治療組大鼠空腹血糖與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。針刺3周、4周后胃脘下俞組、格列美脲組大鼠空腹血糖與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，均低于模型組;而后三里與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 電針對各組大鼠空服血糖的動態(tài)影響(mmol/L，±s)

表1 電針對各組大鼠空服血糖的動態(tài)影響(mmol/L，±s)

注:與空白組比較，△P＜0.01;與模型組比較，＊＊P＜0.05

組別 干預(yù)前 1周末 2周末 3周末 4周末空白組 4.88±0.43 4.66±1.46 4.86±0.64 5.59±0.43 5.45±0.49模型組 16.69±6.12△18.91±8.93△16.07±5.39△28.86±3.06△28.03±4.46△胃脘下俞組 21.21±5.07 10.79±6.12＊＊16.50±7.64 17.51±8.84＊＊16.35±7.86＊＊后三里組 14.68±7.81 11.21±7.41＊＊15.44±7.02 28.10±2.63 24.71±6.05格列美脲組 18.21±5.57 13.00±6.55 15.16±9.64 20.75±6.53＊＊19.47±6.41＊＊

2.2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-B比較

由表2可知，電針干預(yù)可降低T2DM模型大鼠的空腹胰島素水平(P＜0.05);各干預(yù)組大鼠胰島素抵抗指數(shù)明顯高于空白組(P＜0.01)，通過電針干預(yù)均在一定程度上降低T2DM大鼠胰島素抵抗指數(shù)，且胃脘下俞組最優(yōu)(P＜0.01)。各組大鼠胰島B細(xì)胞功能指數(shù)明顯低于空白組(P＜0.01)，各干預(yù)組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，未能明顯改善T2DM大鼠胰島B細(xì)胞功能指數(shù)。

表2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-B比較(±s)

表2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-B比較(±s)

注:與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組比較，＊＊P＜0.01

組別 n FINS(mmol/L)HOMA-IR HOMA-B空白組8 17.45±2.08 4.20±0.44 191.47±61.13模型組 8 17.19±2.45 21.52±5.17△△14.37±3.00△△胃脘下俞組 8 15.29±2.43△11.37±6.31△△＊＊27.89±21.85△△后三里組 8 14.72±2.07△16.40±4.98△△14.93±4.38△△格列美脲組 8 15.65±2.90 13.28±4.88△△＊＊17.43±4.27△△

2.3 干預(yù)前后對T2DM大鼠糖耐受的影響

由表3可知:各組大鼠干預(yù)前后OGTT曲線下面積均明顯高于空白組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);干預(yù)前各治療組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);干預(yù)后與模型組比較，電針胃脘下俞組、格列美脲組OGTT曲線下面積明顯低于模型組(P＜0.05)，而后三里組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 不同穴位電針干預(yù)對大鼠糖耐受的影響(±s，mmol/L·h)

表3 不同穴位電針干預(yù)對大鼠糖耐受的影響(±s，mmol/L·h)

注:與空白組比較，△P＜0.01;與模型組比較，＊＊P＜0.05

組別 n 干預(yù)前OGTT曲線下面積 干預(yù)后OGTT 曲線下面積空白組8 13.94±0.94 16.06±1.83模型組 8 50.03±11.34△63.12±3.49△胃脘下俞組 8 55.62±7.58△43.34±19.56△＊＊后三里組 8 44.73±11.33△58.49±8.89△格列美脲組 8 51.02±6.71△56.04±7.15△＊＊

2.4 各組大鼠血清SOD、MDA含量比較

由表4可知，模型組大鼠SOD活性明顯低于空白組(P＜0.05);而干預(yù)4周后，胃脘下俞組、后三里組大鼠SOD活性明顯高于模型組(P＜0.05)，格列美脲組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。而模型組大鼠MDA含量明顯高于空白組(P＜0.05);干預(yù)4周后，胃脘下俞組、后三里組大鼠MDA含量明顯低于模型組(P＜0.05)，格列美脲組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 干預(yù)4周后各組大鼠血清中SOD、MDA含量比較(±s)

表4 干預(yù)4周后各組大鼠血清中SOD、MDA含量比較(±s)

注:與空白組比較，△P＜0.05;與模型組比較*P＜0.05

組別 n SOD含量(U/ml) MDA含量(nmol/ml)空白組8 80.33±5.05 3.59±0.40模型組 8 66.99±10.91△4.07±0.44△胃脘下俞組 8 78.41±7.53*3.64±0.35*后三里組 8 80.79±12.32*3.58±0.34*格列美脲組8 77.97±15.23 3.64±0.44

3 討論

糖尿病是受遺傳和環(huán)境等多種因素共同作用的代謝性疾病，中醫(yī)屬“消渴”范疇。本實驗采取的T2DM大鼠造模方法，能夠模擬人類T2DM發(fā)病機制，即從飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)展為胰島素分泌量不足以維持正常血糖的過程。同時具有成模率高、死亡率低、血糖穩(wěn)定等特點［11］，值得推廣應(yīng)用于T2DM的研究。

依據(jù)臨床選穴經(jīng)驗并參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，本實驗電針穴位選取胃脘下俞(即胰俞)、后三里(即足三里)。胃脘下俞是治療糖尿病的效穴，《千金要方》載:“消渴，咽喉干，灸胃管下輸三穴各百壯?！蔽鸽湎掠嵛挥诘?胸椎棘突下旁開中線1.5寸，現(xiàn)代理論研究中亦指出，胃脘下俞穴淺層主要分布有第8胸神經(jīng)后支的皮支和伴行的動、靜脈，深層有第8胸神經(jīng)后支的肌支和第8肋間后動、靜脈背側(cè)的分支或?qū)僦В?2］。對該穴進(jìn)行電針刺激可通過第8胸神經(jīng)，將信號傳入胰腺，促進(jìn)其增值、分泌。不論在臨床試驗［13］還是動物實驗［14］中，刺激胃脘下俞對T2DM均有很好的效果。足三里為胃之合穴，胃經(jīng)屬陽明，陽明主闔，使氣趨向里、向下，故曰胃以降為和。足三里為胃經(jīng)下合穴，一者土經(jīng)土穴最應(yīng)胃氣和降之功，二者應(yīng)里，故足三里和降胃氣之功最強。《靈樞·五邪》記載:“邪在脾胃……則熱中善饑……皆調(diào)于三里?！薄夺樉募滓医?jīng)》亦提出:“食不充饑灸三里”，都是足三里治療消渴病的驗證。

從實驗結(jié)果來看，在高糖高脂飼養(yǎng)的前提下，電針胃脘下俞、后三里均能在一定程度上降低T2DM模型大鼠的空腹血糖，并降低其空腹胰島素水平，改善胰島素抵抗，其中電針胃脘下俞穴的作用明顯優(yōu)于電針后三里。OGTT實驗顯示，電針胃脘下俞能明顯改善T2DM大鼠糖耐受情況。另外，SOD具有催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，可清除超氧陰離子自由基，防止細(xì)胞損傷，故可反映機體的抗氧化能力［15］。MDA是過氧化脂質(zhì)降解的產(chǎn)物，可間接反映氧自由基對機體細(xì)胞的損傷程度。本實驗結(jié)果顯示，模型組MDA水平較空白組升高，而SOD活性則明顯降低，說明模型大鼠OS水平增高，氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，而經(jīng)過電針治療后，可通過提高抗氧化物SOD活性、降低MDA含量來平衡OS狀態(tài)，減少FINS的產(chǎn)生，緩解IR，從而治療T2DM。由此可知對持續(xù)高糖高脂下的糖尿病大鼠，電針治療可整體調(diào)節(jié)其OS狀態(tài)，并改善T2DM?？梢?，電針療法與OS、糖尿病之間關(guān)系密切。由于飲食對OS影響密切，故而飲食加電針可能更有利于T2DM的治療。

［1］劉明明.淺談中醫(yī)治療糖尿病的優(yōu)勢［J］.中醫(yī)雜志，2010，51 (z1):46

［2］Abaraogu UO，Ochi C，Umahi E，et al.Individuals with type 2 diabetes are at higher risk of chronic musculoskeletal pain:a study with diabetes cohort［J/OL］.International Journal of Diabetes in Developing Countries，2016(4):1-5［2016-04-09］.doi:10.1007/s13410-016-0489-2

［3］Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.Report of the expert committee on the diagnosis and classification of diabetes mellitus［J］.Diabetes Care，2002，25(Supp.):S5-20

［4］賈偉平.胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)病機制中的作用［J］.診斷學(xué)理論與實踐，2009，8(3):233-236

［5］徐靜，趙琳.針刺治療2型糖尿病肥胖病療效觀察［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，35(4):325-326

［6］張群燕，趙智明，趙凌杰，等.針刺對2型糖尿病患者血清脂連素的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(4):715-716

［7］祁燕，張泳南，謝自敬，等.針刺對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10(43):166-170

［8］張梁，易瑋.針刺對胰島素抵抗模型大鼠骨骼肌胰島素受體底物和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，32 (4):699-704

［9］李愛琴，陸環(huán)，徐文靜，等.氧化應(yīng)激與2型糖尿病的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10(12):2371-2373

［10］石學(xué)敏.針灸學(xué)［M］.2版.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2007:124

［11］何清華，周迎生，王征，等.2型糖尿病大鼠模型制備的影響因素及其特點［J］.中國實驗動物學(xué)報，2007，15(6):425-429

［12］沈雪勇.經(jīng)絡(luò)腧穴學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:249

［13］王媛，劉志誠，徐斌，等.針刺治療女性2型糖尿病療效分析［J］.中國針灸，2014，34(1):21-24

［14］高珊，李瑞，田環(huán)環(huán)，等.電針“胰俞”穴對2型糖尿病大鼠HPA軸相關(guān)激素的影響［J］.中國針灸，2014，34(11):1099-1105

［15］Rider L，Diakonova M.Adapter protein SH2B1beta binds filamin A to regulate prolactin-dependent cytoskeletal reorganization and cell motility［J］.Mol Endocrinol，2011，(257):1231-1243

Effect of Electro-acupuncture on Oxidative Stress and Glucose Metabolism in Rats with Type 2 Diabetes

MA Yan-jia，LI Rui△，JIA Ning，HU Xiao-gang，WANG Yue-ying，TIAN Huan-huan，CAO Bing-yan，ZHANG Shu-jing
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective:To observe the effect of electro-acupuncture(EA)on oxidative stress and glucose metabolism in rats with type 2 diabetes(T2DM)，so as to study its mechanism of improving T2DM.Methods:40 male SD rats were evenly randomized into control，model，“Weiwan Xiashu”，“Housanli”and Glimepiride groups，with 8 rats in each group.The T2DM models were established by feeding high fat and sugar diet combined with intra-peritoneal injection of streptozotocin(35mg/kg).Electro-acupuncture(2 Hz，2 mA)was applied as the intervention，20 minutes every time，6 times per week，lasting for 4 weeks.Body quality and fasting blood glucose(FBG)were measured once a week during the intervention.Fasting serum insulin(FINS)，serum malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)levels were determined by using radioimmunoassay.Oral glucose tolerance test was measured before and after the intervention.In addition，homeostasis model assessment for insulin resistance(HOMA-IR)and modified B cell function index(MBCI)were calculated.Results:The fasting blood glucose was decreased to a certain extent with the application of electro-acu-puncture at Weiwan Xiashu and Housanli.After 4 weeks，F(xiàn)INS and HOMA-IR of T2DM rats were decreased，and the Weiwan Xiashu group was the best(P＜0.01).Compared with those of the control group，F(xiàn)BG and MDA levels of model group were both increased.However，SOD activities were decreased(P＜0.05).Compared with those of the model group，SOD activities of Weiwan Xiashu，Housanli groups were increased(P＜0.05) and MDA levels were decreased(P＜0.05).There was no statistical significance between the Glimepiride group and the model group(P＞0.05).Conclusion:Electro-acupuncture at Weiwan Xiashu and Housanli can reduce fasting blood glucose and may normalize insulin sensitivity，ameliorate insulin resistance and hyperinsulinemia by improving the oxidative stress state as a whole.

Electro-acupuncture;Type 2 diabetes;Glucose metabolism;Oxidative stress

R246.1

A

1005-0779(2017)03-0053-04

2016-08-29

教育部科學(xué)技術(shù)研究重大項目，編號:313010。

馬艷佳(1993-)，女，2014級針灸推拿專業(yè)碩士研究生。

△通訊作者:李瑞(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，研究方向:針灸經(jīng)典理論及腧穴的臨床和實驗研究。