李洪濤，劉 昊，楊方軍，李艷秋，孫曉偉△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040; 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001)

電針對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)的影響*

李洪濤1，2，劉 昊1，楊方軍3，李艷秋2，孫曉偉1，2△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040; 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001)

目的:觀察電針對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)的影響。方法:32只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、DKK1組和電針組，用4%木瓜蛋白酶誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，分別于造模成功后5周和7周取材，觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)變化以及Western Blot法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Wnt3a、β-catenin含量的變化。結(jié)果:正常組大鼠在5周和7周時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Wnt3a蛋白呈低表達(dá)，分別為0.233±0.04和0.193±0.03;而各造模組大鼠，在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Wnt3a蛋白含量均有不同程度的升高，其中電針組、DKK1組均較模型組有所降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而此兩組間比較無(wú)差異(P＞0.05)。正常組大鼠在5周和7周時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)β-catenin蛋白呈低表達(dá)，分別為0.163±0.04和0.143±0.03;而各造模組大鼠，在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)β-catenin蛋白含量均有不同程度的升高，其中電針組、DKK1組均較模型組有所降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而此兩組間比較無(wú)差異(P＞0.05)。結(jié)論:電針可能是通過(guò)下調(diào)Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)、抑制Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而保護(hù)受損的關(guān)節(jié)軟骨，改善膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)。

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎;針刺;Wnt3a蛋白;β-catenin蛋白;Wnt信號(hào)通路

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一種慢性膝骨關(guān)節(jié)退行性疾病，以膝關(guān)節(jié)軟骨變性和退行性病變?yōu)橹?，伴有膝關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、變形以及活動(dòng)障礙等癥狀。在此病變過(guò)程中，膝骨關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜、軟骨等內(nèi)在組織也參與骨性關(guān)節(jié)炎的病理生理變化過(guò)程，嚴(yán)重影響了患者日常生活活動(dòng)和生活質(zhì)量［1-2］。近年來(lái)，部分學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，軟骨細(xì)胞的增殖、分化、成熟、凋亡參與了KOA病理改變的過(guò)程，同時(shí)也對(duì)這一過(guò)程起到重要作用。而Wnt信號(hào)通路參與了軟骨的發(fā)育、形成以及受損后修復(fù)，并且調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞周期性變化和代謝過(guò)程［3-4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)4%木瓜蛋白酶誘導(dǎo)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，研究電針對(duì)關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)的影響，目的是從分子水平探討電針對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用及可能的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

符合國(guó)家二級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)雄性健康清潔級(jí)SD大鼠［哈爾濱市獸醫(yī)研究所，質(zhì)量合格證書(shū)號(hào):SCXK(黑) 20100027］，體質(zhì)量(300±20)g。動(dòng)物室飼養(yǎng)條件，室溫18℃ ～22℃，光照周期14 h(06:00～20:00)，濕度為(50±5)%，自由取食、飲水，造模前禁水、禁食，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡可能減少動(dòng)物痛苦。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DKK1(StemRD，DKK-025B);Rabbit Anti-Wnt3a antibody(Proteintech，ag17232);Rabbit Antiβ-catenin antibody(Proteintech，51067-2-AP); HRP-羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司); DAB顯色試劑盒(Vector，USA)。

1.3 KOA模型建立

根據(jù)Pomonis JD［5］方法制備KOA大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)進(jìn)行麻醉，固定備皮，消毒皮膚，曲屈大鼠膝關(guān)節(jié)，于關(guān)節(jié)兩側(cè)進(jìn)針，將4%木瓜蛋白酶水溶液0.2 ml注射到膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，分別于1、4、7天重復(fù)此操作，并在第1次注射2周后進(jìn)行膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)估級(jí)別，總分大于4分表示造模成功，可納入進(jìn)行分組干預(yù)。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù)方法

將32只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、電針組和DKK1組(Wnt抑制劑組)，每組8只大鼠。所有造模組大鼠又按造模成功后5周、7周分為2個(gè)亞組，每亞組4只大鼠。正常組也于這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為2個(gè)亞組，每組4只。所有大鼠分別于造模成功后5周和7周分批處死取材。

正常組:不造模，常規(guī)飼養(yǎng)，不給予治療。

模型組:造模后2周(即造模成功)，行膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水0.1 ml，每周1次;并且每天給予電針組動(dòng)物同樣方法束縛30 min，每周休息2天。

電針組:造模后2周(即造模成功)，行膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水0.1 ml，每周1次;并且每天將大鼠固定在特制的鼠架上，將四肢固定，給予電針治療，取穴太溪穴、曲泉穴(兩穴接一組電針，同側(cè)相連，正極在上，負(fù)極在下)，內(nèi)外膝眼對(duì)向透刺(兩穴接一組電針)，疏密波刺激(Hl為3 Hz，H2為100 Hz，電壓為2 v)，以下肢肌肉收縮引起肢體或針柄輕微顫動(dòng)為宜，留針30 min，每周休息2天。

DKK1組:造模后2周(即造模成功)，行膝關(guān)節(jié)腔注射0.1 ml濃度為100 μm/L的Wnt阻斷劑DKK1，每周1次;并且每天給予電針組動(dòng)物同樣方法束縛30 min，每周休息2天。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.5.1 標(biāo)本大體評(píng)分 標(biāo)本大體觀察:造模成功后5周、7周時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后，給予過(guò)量水合氯醛腹腔注射麻醉處死，觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］:0分，關(guān)節(jié)面光滑;1分，關(guān)節(jié)面粗糙;2分，關(guān)節(jié)面糜爛;3分，關(guān)節(jié)面潰瘍;4分，軟骨剝脫。

1.5.2 Western Blot測(cè)定方法 組織蛋白用RIPA裂解緩沖液提取，蛋白BCA測(cè)試盒檢測(cè)總蛋白的濃度。每個(gè)孔裝載樣本蛋白50 μg。目標(biāo)蛋白經(jīng)過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在脫色搖床上，PVDF膜用5%脫脂奶粉的 TBST緩沖液室溫封閉 2 h。PVDF膜用一抗(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜，然后二抗室溫孵育2 h，每個(gè)過(guò)程之間用 TBST緩沖液清洗3次。Image J軟件(NIH，Bethesda，MD，USA)計(jì)算條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用ANOVA方差分析，多重比較用LSD或者SNK法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本評(píng)分比較

模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本評(píng)分明顯高于正常組，與同時(shí)間點(diǎn)正常組比較，P＜0.05;電針組大鼠軟骨標(biāo)本評(píng)分明顯低于模型組和DKK1組，與同時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.01。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中Wnt蛋白免疫印跡結(jié)果

Wnt蛋白在各組不同時(shí)間點(diǎn)均較正常組表達(dá)增高;與模型組比較電針組、DKK1組(Wnt抑制劑組)均能在5周和7周時(shí)間點(diǎn)，降低Wnt蛋白的表達(dá)(P＜0.01);而電針組與 DKK1組比較無(wú)明顯差異(P＞ 0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本評(píng)分比較(例)

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中Wnt蛋白免疫印跡比較(±s)

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中Wnt蛋白免疫印跡比較(±s)

注:與正常組比較，△P＜0.05;與模型組比較，★P＜0.01;與DKK1組比較，☆P＞0.05

組別 例數(shù) 造模成功后5周 造模成功后7周正常組8 0.233±0.04 0.193±0.03模型組 8 0.882±0.05△0.793±0.06△電針組 8 0.542±0.08△★☆0.459±0.07△★☆DKK1組 8 0.521±0.06△★0.438±0.07△★

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin蛋白免疫印跡結(jié)果

β-catenin蛋白在各組不同時(shí)間點(diǎn)均較正常組表達(dá)增高;與模型組比較，電針組、DKK1組(Wnt抑制劑組)均能在5周和7周時(shí)間點(diǎn)，降低β-catenin蛋白的表達(dá)(P＜0.01);而電針組與DKK1組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin蛋白免疫印跡比較(±s)

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin蛋白免疫印跡比較(±s)

注:與正常組比較，△P＜0.05;與模型組比較，★P＜0.01;與DKK1組比較，☆P＞0.05

組別 例數(shù) 造模成功后5周 造模成功后7周正常組8 0.163±0.04 0.143±0.03模型組 8 0.864±0.06△0.773±0.07△電針組 8 0.492±0.08△★☆0.388±0.07△★☆DKK1組 8 0.473±0.06△★0.369±0.07△★

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是由外因和內(nèi)因綜合導(dǎo)致的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變或關(guān)節(jié)軟骨破壞，從而使關(guān)節(jié)功能出現(xiàn)障礙的一種慢性退行性疾病。存在于細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖含量下降和Ⅱ型膠原纖維的變形是膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要因素。而Wnt信號(hào)通路對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的形成和分化，在不同時(shí)期起不同的雙向調(diào)節(jié)作用，它不僅調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)也促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡［7-8］。在相關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯恐锌梢园l(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路與軟骨細(xì)胞及骨性關(guān)節(jié)炎之間存在高度的相關(guān)性。Delgado等［9］在患者軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)，骨折患者細(xì)胞核中β-連環(huán)蛋白要比膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者少，也就是說(shuō)明同等的炎癥刺激下，由于受到更多Wnt蛋白的刺激，上調(diào)了膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響到軟骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)核代謝。Chan等［10］發(fā)現(xiàn)Wnt3a能降低低齡動(dòng)物成肌細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)結(jié)締纖維組織增生呈老化表現(xiàn)。彭旭等［11］在膝骨性關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)Wnt3a和β-catenin蛋白水平明顯高于正常對(duì)照組，可能提示W(wǎng)nt信號(hào)通路被激活，進(jìn)而MPCs向軟骨細(xì)胞的分化能力降低，阻斷Wnt信號(hào)通路后向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力有所恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，與正常組比較，均有不同程度損傷，在造模成功后5周和7周時(shí)間點(diǎn)上看，DKK1組能改善關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度，說(shuō)明抑制Wnt蛋白的表達(dá)可以減輕骨性關(guān)節(jié)炎的受損程度，而電針組與之比較能更好的保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，降低關(guān)節(jié)軟骨的損傷。在免疫印跡檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型能夠激活Wnt信號(hào)通路，影響軟骨細(xì)胞代謝能力，從而降低其修復(fù)受損組織的能力。在模型組基礎(chǔ)上注射DKK1(Wnt抑制劑)能下調(diào)Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)，并能改善關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度。值得一提的是，電針干預(yù)也能起到類似的保護(hù)關(guān)節(jié)的作用，與注射DKK1相比，亦能明顯下調(diào)Wnt、β-catenin蛋白的表達(dá)，同時(shí)也能較大程度的改善受損關(guān)節(jié)軟骨，說(shuō)明電針在一定程度上可能是通過(guò)下調(diào)Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)、抑制Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而保護(hù)受損關(guān)節(jié)軟骨，改善膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能癥狀。

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Effect of Electroacupuncture on Protein Expressions of Wnt3a and β-catenin in Arthrodial Cartilage of Knee Osteoarthritis Rats

LI Hong-tao1，2，LIU Hao1，YANG Fang-jun3，LI Yan-qiu2，SUN Xiao-wei1，2△
(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;3.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150001，China)

Objective:To observe the effect of electroacupuncture on Wnt3a，β-catenin protein expression in arthrodial cartilage of knee osteoarthritis rats.Methods:32 healthy male SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，a DKK1 group and an EA group.Induce the rat models of knee osteoarthritis by 4%papain，and use them on the 5th week and 7th week after modeling successfully.Observe the morphological changes of articular cartilage in rats and use Western Blot method to detect the content changes of Wnt3a and β-catenin in articular cartilage rats.Results:The expressions of Wnt3a protein in articular cartilage was low in the normal group on the 5th and 7th weeks，and they were about 0.233±0.04 and 0.193±0.03，respectively; while rats in each model group，the contents of Wnt3a protein in articular cartilage were increased to different degrees at two time points.EA group and DKK1 group were lower than the model group，and it had a statistically significant difference(P＜0.05)，but there was no difference between EA group and DKK1 group(P＞0.05).In the normal group，the expressions of β-catenin protein in articular cartilage was low on the 5th and 7th weeks，and they were about 0.163±0.04 and 0.143±0.03，respectively;while in each model group，the contents of β-catenin protein in articular cartilage were increased to different degrees at two time points.EA group and DKK1 group were lower than the model group，and it had a statistical significance(P＜0.05)，but there was no difference between EA group and DKK1 group(P＞0.05).Conclusion:EA may reduce the expressions of Wnt3a and β-catenin protein，inhibit the Wnt signaling pathway，and then protect the damaged articular cartilage to improve the joint structure and function of knee osteoarthritis rats.

Knee osteoarthritis;Acupuncture;Wnt3a protein;β-catenin protein;Wnt signaling pathway

R245.97

A

1005-0779(2017)03-0065-04

2016-09-07

黑龍江省博士后資助項(xiàng)目，編號(hào):LHB-Z12265.

李洪濤(1979-)，男，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，在站博士后，研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療骨與關(guān)節(jié)疾病研究。

△通訊作者:孫曉偉(1979-)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，在站博士后，研究方向:針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與機(jī)理研究。