(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161006)

黃芪發(fā)酵菌的篩選鑒定及纖維素酶學(xué)性質(zhì)試驗

王巖，劉宇，侯美如，尹珺伊，朱慶賀，秦平偉，史同瑞

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161006)

為分離發(fā)酵黃芪菌株，試驗采取黃芪樣品接種營養(yǎng)瓊脂，置30℃環(huán)境培養(yǎng)。取分離菌接種纖維素剛果紅瓊脂，篩選能形成較大降解圈的細(xì)菌進行鑒定，并測定其纖維素酶性質(zhì)。結(jié)果表明，篩選菌為解淀粉芽孢桿菌，該菌株降解圈直徑(H)與菌落直徑(C)的比值(H/C)為4.03。在37℃環(huán)境培養(yǎng)36 h酶活力達(dá)到高峰，為32.16 U/mL。在低于60℃及pH值6.0～8.0環(huán)境纖維素酶較穩(wěn)定，可保持酶活力90%以上。

黃芪;中藥發(fā)酵;纖維素酶;解淀粉芽孢桿菌

現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)是結(jié)合現(xiàn)代生物工程學(xué)、微生態(tài)學(xué)、發(fā)酵工程學(xué)等學(xué)科技術(shù)，在中藥傳統(tǒng)發(fā)酵炮制方法的基礎(chǔ)上發(fā)展形成的現(xiàn)代中藥制藥新技術(shù)。中草藥細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等成分構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)，有效成分大多包裹在細(xì)胞壁內(nèi)。應(yīng)用煎煮等傳統(tǒng)方法提取中藥時，胞內(nèi)有效成分向提取介質(zhì)中擴散需要克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的雙重阻力，有效成分不易游離至提取介質(zhì)中。應(yīng)用降解纖維素的微生物發(fā)酵中藥，微生物分泌的纖維素酶可裂解細(xì)胞壁纖維，有利于中藥有效成分向胞外釋放，提高中藥的提取率［1］。

源于細(xì)菌的纖維素酶不僅具有耐堿、耐熱等優(yōu)良特性，而且細(xì)菌生長周期短，發(fā)酵工藝簡單，易于控制，因此產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌研究廣受重視［2－3］。由于產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌具有抗逆性強、易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點，因而更具應(yīng)用前景。本試驗從黃芪樣品中分離篩選出1株產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌，并測定了酶學(xué)特性，以期用于黃芪的生物發(fā)酵。

1 材料與方法

1．1 藥材與試劑黃芪，購自河北凱達(dá)藥業(yè)有限公司;TaKaRa Mini BEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver．3．0、EX Taq酶和dNTP，均購自大連寶生物工程有限公司;Marker DL－2000，購自Genstar公司;瓊脂糖，購自O(shè)XOID公司。

1．2 培養(yǎng)基黃芪瓊脂:黃芪粉100 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，牛肉湯1 000 mL，pH值7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉10 g，葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7．2。

1．3 DNS試劑參照文獻(xiàn)［4－5］，稱取3，5－二硝基水楊酸6．3 g溶于約700 mL蒸餾水中，然后加入0.2 g/mL氫氧化鈉溶液100 mL，攪拌均勻，依次加入四水酒石酸鉀鈉182 g、苯酚5 g、無水硫酸鈉5 g，溶解后用蒸餾水定容至1 000 mL。

1．4 黃芪發(fā)酵菌篩選取黃芪樣品接種營養(yǎng)瓊脂，置30℃環(huán)境培養(yǎng)。取生長菌接種黃芪瓊脂、點種纖維素剛果紅瓊脂，置30℃環(huán)境培養(yǎng)，篩選能在黃芪瓊脂生長，并在剛果紅培養(yǎng)基形成較大降解圈的細(xì)菌。測量篩選菌水解透明圈直徑(H)與菌落直徑(C)的比值(H/C)，初步判定篩選菌降解纖維素的活力［6－7］。

1．5 分子生物學(xué)鑒定按DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA。應(yīng)用細(xì)菌通用引物擴增16S rRNA，P1:5'－GAGCGGATAACAATTTCACACAGG－3'; P2:5'－CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC－3'。PCR反應(yīng)體系50 μL，其中TaqDNA聚合酶0．5 μL、10×PCR reaction Buffer 5 μL，模板DNA 2 μL，dNTP為1 μL，上下游引物各2 μL，去離子水補至50 μL。擴增條件:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火復(fù)性40 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物于0．8%瓊脂糖凝膠檢測后測序。利用NCBI－BLAST搜索程序從GenBank進行同源性檢索，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1．6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取試管分別加入1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，再依次加入蒸餾水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6 mL，然后各管加DNS試劑2 mL，置沸水浴5 min。以對照調(diào)零，于490 nm處測定各管OD值。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．7 纖維素酶學(xué)性質(zhì)測定

1．7．1 產(chǎn)酶曲線測定參照文獻(xiàn)［7－12］方法測定酶活力。在菌株發(fā)酵培養(yǎng)18～72 h，每隔6 h取樣1次，測定發(fā)酵液中纖維素酶酶活力。以時間為橫軸，以纖維素酶活力為縱軸繪制曲線，即得該菌產(chǎn)酶曲線。

1．7．2 熱穩(wěn)定性測定取試管分別加入發(fā)酵液3 mL，試驗管分別置20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃環(huán)境，對照管置室溫環(huán)境，作用1 h后測定相對酶活力，纖維素酶穩(wěn)定性以存余酶活力與對照酶活力的百分率表示。

1．7．3 酸堿穩(wěn)定性測定取試管分別加入發(fā)酵液3 mL，用2 mol/L鹽酸或氫氧化鈉分別調(diào)各管發(fā)酵液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，對照管不作處理，置30℃環(huán)境作用1 h，各管用檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液調(diào)至9 mL，然后測定相對酶活力，計算剩余酶活力的百分率。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株篩選結(jié)果從黃芪樣品中篩選出1株能在黃芪瓊脂生長，且在剛果紅瓊脂形成較大降解圈的細(xì)菌，菌株H/C為4.03，據(jù)此判斷該菌株降解纖維能力較強。

2.2 PCR擴增及系統(tǒng)進化樹分析以菌株總DNA為模板，采用16S rRNA引物P1、P2進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增獲得目的片段約500 bp，結(jié)果如圖1。

圖1 目的基因PCR擴增結(jié)果M:DL－2 000DNA Marker;1、2:PCR產(chǎn)物;3:陰性對照

擴增序列長度為574 bp，經(jīng)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫序列比對，該序列與解淀粉芽孢桿菌IHBB2284及MD33同源性達(dá)100%。同時構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，見圖2。結(jié)果表明，篩選菌株與解淀粉芽孢桿菌IHB B2284株及MD33株在同一分支中，確定該菌為解淀粉芽孢桿菌，并命名為解淀粉芽孢桿菌SSY1株。

圖2 菌株16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹

2．3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線依據(jù)不同含量葡萄糖溶液在波長490 nm處測定的OD值，得回歸方程y= 0.8651x－0．0323，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

2．4 酶學(xué)性質(zhì)

2．4．1 不同培養(yǎng)時間纖維素酶活力不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液的纖維素酶活力曲線見圖4。在菌株發(fā)酵培養(yǎng)36 h纖維素酶活力達(dá)到最大值，為32.16 U/mL，此后至培養(yǎng)72 h，纖維素酶活力呈平穩(wěn)波動狀態(tài)。見圖4。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 酶活力測定結(jié)果

2．4．2 纖維素酶熱穩(wěn)定性將發(fā)酵液分別置不同溫度環(huán)境作用1h，酶活力測定結(jié)果見圖5。在低于60℃環(huán)境中纖維素酶較為穩(wěn)定，酶活力均維持在最高酶活力的90%以上。當(dāng)溫度高于60℃時纖維素酶活力失活加劇，當(dāng)溫度為80℃時，纖維素酶活力下降至最高酶活的30%以下。

圖5 熱穩(wěn)定性測定結(jié)果

2．4．3 纖維素酶酸堿穩(wěn)定性將發(fā)酵液分別置不同酸堿度的環(huán)境中作用1h，酶活力測定結(jié)果見圖6。纖維素酶力在pH值7．0最穩(wěn)定，相對酶活力為99.51%，在pH值6.0～8.0環(huán)境纖維素酶具有較好穩(wěn)定性，相對酶活力保持在90%以上，在pH值3.0環(huán)境最不穩(wěn)定，相對酶活力僅為22.15%。

圖6 酸堿穩(wěn)定性測定結(jié)果

3 討論

中藥生物發(fā)酵是現(xiàn)代中藥炮制領(lǐng)域的研究熱點，選育優(yōu)良發(fā)酵菌種是發(fā)酵中藥的技術(shù)關(guān)鍵。目前用于發(fā)酵黃芪的菌種主要有保加利亞乳桿菌、乳酸菌、香菇真菌、靈芝真菌、傘枝犁頭霉菌和糙皮側(cè)耳菌等［14－15］。本試驗從黃芪樣品中分離出一株具有降解纖維能力，能在黃芪培養(yǎng)基生長的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定為解淀粉芽孢桿菌。該菌株營養(yǎng)要求低，適應(yīng)性強，安全性良好，有望作為發(fā)酵黃芪的候選菌株。

DNS方法是測定纖維素酶活力的常用方法，具有操作簡便，精確度較高等優(yōu)點，但易受酶力和底物濃度等條件的影響［1，9］。本試驗分離的解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)纖維素酶活力為32.16 U/mL，與李紅亞等［16］報道的解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活力45.4 U/g較近，而遠(yuǎn)低于崔海洋等［17］報道的解淀粉芽孢桿菌菌株所產(chǎn)纖維素酶活力307.23 U/mL，以及王凱等［18］報道的纖維素酶酶活力135.8 U/mL。由于DNS方法中纖維素濃度、反應(yīng)體系加量，以及測定波長的差異性，因此各學(xué)者測定的結(jié)果可比性也不強。依據(jù)篩選菌在剛果紅培養(yǎng)基形成的降解圈，初步判斷該菌株具有中等降解纖維素活力［6－7，18］。

目前，用于發(fā)酵中藥的菌種主要為細(xì)菌和食用真菌，本試驗分離的解淀粉芽孢桿菌在室溫條件下能在含黃芪的培養(yǎng)基上正常生長，且安全性良好，這為應(yīng)用本菌發(fā)酵黃芪奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

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Study on Screening and Identification of a strain for fermentation of Radix Astragalus and its Enzymic Characters

WANG Yan，LIU Yu，HOU Mei-ru，YIN Jun-yi，ZHU Qing-he，QIN Ping-wei，SHI Tong-rui
(Heilongjiang Institute of Veterinary Medicine Science，Qiqihaer 161006，China)

In order to isolate the strains which have fermenting performance for Radix Astragalus，the Radix Astragali samples were inoculated on nutrient agar medium and cultivation at 30℃，and then the isolating strains were inoculated on the cellulose-congo red agar，Screening the bacteria which can form a larger cellulose-decomposing zone to identification based on molecular biological method was performed，and the activity of the cellulose was determined．The results showed that the isolated strain was identified as Bacillus amyloliq-uefaciens，and the ratio of H/C was 4.03．The highest cellulase activity reached 32.16 U/mL when cultivated at 37℃for 36 h．The cellulase activity was stable at temperatures lower than 60℃and at pH range of 6.0－8．0，which retained more than 90%．

Radix Astragalus;Fermentation of Chinese herbal medicine;Cellulase;Bacillus amyloliquefaciens

SHI Tong-rui

A

0529-6005(2017)01-0100-03

2015-07-21

黑龍江科技計劃項目(GC13B404)

王巖(1976－)，女，高級獸醫(yī)師，本科，從事微生態(tài)制劑研發(fā)工作，E-mail:wangyan200705@sina．com

史同瑞，E-mail:systr@sina．com