李軍

[摘 要] 核苷（酸）類似物（NA）是目前臨床治療乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染的首選方案，但隨著治療時(shí)間的延長，HBV耐藥性的產(chǎn)生極易對治療效果造成影響。HBV耐藥性檢測包括基因型耐藥和表型耐藥分析兩種手段，其中前者可明確HBV基因組中已知與耐藥相關(guān)的病毒變異，在近年來病毒耐藥性檢測領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。本文就HBV耐藥原因以及DNA直接測序技術(shù)、焦磷酸測序技術(shù)等十余種基因型耐藥檢測方案進(jìn)行綜述，旨在為強(qiáng)化HBV耐藥管理提供參考。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒；耐藥；檢測；進(jìn)展

中圖分類號：R446 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-5200（2017）01-025-03

DOI：10.11876/mimt201701010

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，目前全球乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）慢性感染者為3.5億，其中30%患者已進(jìn)展至肝硬化階段，需及時(shí)實(shí)施長期、有效的抗病毒治療[1]。干擾素和核苷（酸）類似物（NA）兩大類抗病毒藥物是目前臨床治療HBV感染的主要藥物，其中，NA以其服用方便、安全性高、抑制病毒復(fù)制作用明確等優(yōu)勢，得到了廣泛應(yīng)用[2]。但其缺陷在于，需長期服用方可將HBV抑制在較低水平，降低肝硬化、肝癌等繼發(fā)疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而長期服用NA可誘導(dǎo)HBV耐藥突變的發(fā)生，加之近年來低耐藥屏障NA序貫應(yīng)用的逐步推廣，HBV多藥耐藥為臨床治療帶來了更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[3-4]。本文就HBV耐藥機(jī)制、耐藥檢測及防治策略進(jìn)行綜述，旨在為HBV耐藥的監(jiān)測與分析提供參考。

1 HBV耐藥原因

1.1 HBV耐藥機(jī)制

缺乏校正的逆轉(zhuǎn)錄伴隨著HBV復(fù)制的全過程，若HBV基因突變位點(diǎn)恰好處于HBV-DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)域，則極有可能導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[5]。應(yīng)用抗病毒藥物治療前，慢性乙肝患者體內(nèi)往往并不存在耐藥株，均為野生株，但抗病毒藥物對HBV的選擇性作用，可逐漸導(dǎo)致藥物敏感野生株逐漸減少、耐藥株獲得生存，繼而成為優(yōu)勢病種株，最終引發(fā)HBV總體耐藥性的產(chǎn)生[6]。

1.2 HBV耐藥因素

研究表明，藥物的空間結(jié)構(gòu)、基因屏障及藥代動力學(xué)特征均在耐藥性的產(chǎn)生環(huán)節(jié)扮演了重要角色[7]。如拉米夫定與三磷酸脫氧胞苷（dCTP）結(jié)構(gòu)差異明顯，但阿德福韋酯與dCTP十分接近，故前者更易發(fā)生HBV耐藥。Lee等[8]發(fā)現(xiàn)，拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定在發(fā)生耐藥變異時(shí)，HBV耐藥株僅1個位點(diǎn)發(fā)生突變，而恩替卡韋耐藥株需在上述突變基礎(chǔ)上發(fā)生3個位點(diǎn)聯(lián)合突變，故初治患者恩替卡韋耐藥率極低。若抗病毒藥物可同時(shí)強(qiáng)烈抑制野生株、耐藥株復(fù)制，則其藥代動力學(xué)優(yōu)勢可保證HBV處于較低的耐藥性。除抗病毒藥物自身因素外，患者HBV-DNA定量、病程、年齡、依從性、治療方案、病情等基礎(chǔ)狀態(tài)亦可對HBV耐藥性造成明顯影響[9]。

1.3 HBV耐藥分類

HBV耐藥包括基因耐藥、交叉耐藥兩種類型，其中基因耐藥即為HBV基因序列發(fā)生耐藥相關(guān)基因突變，若該基因突變導(dǎo)致病毒株對藥物敏感性降至野生株的25%以下，則被稱為表型耐藥；交叉耐藥是指病毒在發(fā)生基因耐藥的同時(shí)，不僅對某一種藥物耐藥，且同時(shí)對另外一種無關(guān)藥物存在耐藥性。目前臨床常用抗病毒藥物的耐藥性分別為：拉米夫定20%～69%，阿德福韋酯11%～29%，恩替卡韋9%，替比福定2%～4%，隨用藥時(shí)間的延長，其耐藥性不斷增加[10]。

2 HBV耐藥檢測

2.1 DNA直接測序技術(shù)

DNA直接測序技術(shù)是最為經(jīng)典的HBV耐藥檢測方法，在所有耐藥變異檢測技術(shù)中，DNA直接測序技術(shù)的準(zhǔn)確性、特異性均處于較高水平，且多數(shù)學(xué)者均將該技術(shù)作為檢測其他技術(shù)功效的對比標(biāo)準(zhǔn)[11]。但由于該技術(shù)耗時(shí)久、經(jīng)濟(jì)性差、技術(shù)落后、檢出限高達(dá)20%，且易出現(xiàn)混合感染中少量HBV感染的漏檢，近年來應(yīng)用逐漸減少。

2.2 焦磷酸測序技術(shù)

焦磷酸測序在DNA直接測序技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，是借助DNA合成過程中釋放的焦磷酸判斷HBV耐藥情況的新型酶級聯(lián)二代測序技術(shù)，與過往Sanger法ddNTP參與的鏈終止反應(yīng)相比，該技術(shù)不需電泳、熒光標(biāo)記，且分析快速、靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)自動化定量分析。有學(xué)者將該技術(shù)用于HBV突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)10 min即可完成接近100份樣本的檢測，且檢出限低至4%[12]。但其不足之處在于閱讀長度僅為40 bp，覆蓋范圍有限，故羅氏最新研發(fā)的454 GS FLX測序平臺在該技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，提供了超深度焦磷酸測序技術(shù)，將其閱讀長度延伸至250 bp，檢出限進(jìn)一步升至1%，其高靈敏度、特有基因頻率分析功能得到了廣泛認(rèn)可，但同時(shí)也大大增加了設(shè)備成本以及數(shù)據(jù)復(fù)雜性，臨床推廣受限[13]。

2.3 拉鏈核酸檢測技術(shù)

拉鏈核酸（ZNA）是一種寡核苷酸，可以拉鏈形式連接互補(bǔ)核苷酸，故被稱為“拉鏈核酸”，其可被陽離子精胺衍生物單元（Z單元）修飾，進(jìn)而減少核苷酸鏈之間負(fù)電荷排斥力、提升引物和探針退火溫度，在增強(qiáng)雙鏈雜交穩(wěn)定性及錯配識別能力方面具有重要作用[14]。由于ZNA的Tm值僅受Z單元數(shù)量、寡核苷酸鏈長度影響，其探針設(shè)計(jì)極為簡便、靈活。有學(xué)者針對HBV YMDD、YVDD、YSDD、YIDD序列設(shè)計(jì)不同的探針，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)突變病毒載量檢測底線可達(dá)35 copies/mL，是其他技術(shù)檢測底線的300倍以上，且其靈敏性、特異性均較高，為野生、突變株的定量比例計(jì)算提供了可能，亦可動態(tài)監(jiān)測耐藥株比例的實(shí)時(shí)變化[15]。其缺陷在于，需針對不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同ZNA探針，雖然探針設(shè)計(jì)較為簡便，但仍為臨床工作者增加了較大的工作量負(fù)擔(dān)。

2.4 AllGlo探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)

目前TaqMan探針、分子信標(biāo)、雜交探針、雙鏈置換探針等實(shí)時(shí)PCR探針應(yīng)用十分廣泛，在此基礎(chǔ)上，AllGlo探針不僅具有上述探針全部的優(yōu)點(diǎn)，還具有更高的熒光強(qiáng)度、檢測靈敏度、特異性及廣泛的可選熒光種類，有學(xué)者將AllGlo探針同時(shí)用于四種人乳頭瘤病毒的單管檢測，取得了良好的效果[16]。Kitrinos等[17]設(shè)計(jì)HBV YMDD、YIDD、YVDD的針對性AllGlo探針，發(fā)現(xiàn)其檢測限達(dá)50 copies/mL，且與直接測序法比較未發(fā)現(xiàn)不一致結(jié)果，顯現(xiàn)出該技術(shù)較高的準(zhǔn)確性。需要注意的是，AllGlo探針在保持高靈敏度的同時(shí)，對靶序列保守性的要求極高，故在突變率較高的HBV耐藥性檢測方面，適用性不夠廣泛。

2.5 量子點(diǎn)DNA熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器技術(shù)

量子點(diǎn)DNA熒光共振能量轉(zhuǎn)移（QDs-DNA-FRET）技術(shù)在單核苷酸多態(tài)性、微量DNA的檢測中得到了廣泛關(guān)注，其檢測方法僅需3步，分別為連接量子點(diǎn)表面形成功能性QDs-DNA連接體、向連接體內(nèi)加入報(bào)告探針、應(yīng)用FRET及寡核苷酸連接酶檢測反應(yīng)測定熒光信號。突變型HBV存在的單堿基錯配可導(dǎo)致QDs-DNA復(fù)合體雜交失敗，故無法參與FRET反應(yīng)，亦無熒光信號產(chǎn)生[18]。其優(yōu)勢在于無須PCR擴(kuò)增、特異性佳，且具有高效性、快速性，可同時(shí)實(shí)施多位點(diǎn)檢測，同時(shí)，檢測設(shè)備僅需多標(biāo)記分析儀，易于臨床實(shí)驗(yàn)室推廣。但該技術(shù)亦需應(yīng)用大量配套特殊試劑，是限制其推廣的主要原因。

2.6 PCR侵入技術(shù)

與其他PCR技術(shù)的差別在于，PCR侵入技術(shù)不是對目的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，而是實(shí)施探針信號擴(kuò)增，通過侵入探針、信號探針、靶核酸分子檢測和側(cè)翼核酸內(nèi)切酶3個體系，該技術(shù)可迅速分開熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)，其檢測下限為10 copies/mL，耐藥病毒株檢測比例可低至2%，且其對信號DNA進(jìn)行擴(kuò)增可大大降低檢測過程中造成的污染，具有較強(qiáng)的特異性[19]。該技術(shù)的不足之處與ZNA檢測技術(shù)類似，即需根據(jù)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)對應(yīng)的侵入探針、信號探針，在一定程度上增加了檢測的煩瑣度。

2.7 限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)

限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)主要借助DNA限制性內(nèi)切酶特性，切割已知HBV耐藥突變并行PCR擴(kuò)增，從而區(qū)分HBV耐藥突變與非HBV耐藥突變。其優(yōu)勢在于操作簡便、一次性可檢測大量突變、靈敏度和特異性均較高，但其優(yōu)勢也同樣明顯，即對于變異快速的HBV，無法及時(shí)制作針對性限制性內(nèi)切酶，導(dǎo)致檢測失敗。此外，Ayres等[20]指出，若擴(kuò)增產(chǎn)物可被限制性內(nèi)切酶識別，則可能導(dǎo)致目標(biāo)片段酶活性競爭，影響檢測結(jié)果。

2.8 基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)是近年來新興的一種HBV耐藥檢測技術(shù)，其主要分析野生型HBV與變異型HBV間分子量差別，以明確耐藥基因突變，其重復(fù)性、特異性、靈敏度均較高，但檢測限僅為100 copies/mL，不及上述其他技術(shù)[21]。

2.9 其他技術(shù)

目前實(shí)驗(yàn)室明確HBV耐藥株的方法多種多樣，除上述8種技術(shù)外，還存在肽核酸分析技術(shù)、基因芯片技術(shù)、連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)、線性探針雜交法、依賴轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的表型耐藥檢測等[22-26]，為DNA直接測序的替代提供了新的方向，但各種技術(shù)也或多或少的存在一定缺陷，如肽核酸分析技術(shù)的突變株結(jié)果難以解釋、基因芯片技術(shù)成本極高、連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)檢測限偏高、線性探針雜交法易漏檢、依賴轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型僅可明確表型耐藥但無法了解基因型耐藥等。因此，如何綜合上述技術(shù)的優(yōu)勢，盡可能尋求一種安全、經(jīng)濟(jì)、可靠、簡便的檢測方案，仍是醫(yī)學(xué)工作者需要繼續(xù)努力的方向。

3 展望

HBV耐藥是乙型肝炎長期治療中的最大難題，密切檢測HBV耐藥甚至多重耐藥的發(fā)生，方為降低嚴(yán)重臨床結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、改善患者預(yù)后質(zhì)量的關(guān)鍵。當(dāng)前關(guān)于抗病毒藥物耐藥的技術(shù)眾多，且多數(shù)處于起步階段，適用性、推廣性均較為有限，對于各類現(xiàn)象、規(guī)律的認(rèn)知亦不夠完善。但各類技術(shù)在近幾年已取得了飛速的發(fā)展，醫(yī)學(xué)工作者亦朝著低成本、高通量技術(shù)方向不斷努力，未來HBV耐藥檢測可著力于明確HBV耐藥演變，了解HBV耐藥發(fā)生發(fā)展關(guān)聯(lián)。同時(shí)，隨著耐藥突變的早期檢出，有望涌現(xiàn)出更多靶標(biāo)抗病毒藥物，為抗病毒治療方案的個體優(yōu)化、臨床療效的提升、患者預(yù)后的改善及HBV耐藥株的減少提供更多可能性。

參 考 文 獻(xiàn)

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