呂甜甜 王宏亮 邢瑋 吳晏 王偉 張子劍 韓靜

·論著·

附子對(duì)高糖刺激下施萬(wàn)細(xì)胞中Krox20-Oct6信號(hào)通路及其調(diào)控的髓鞘蛋白的影響

呂甜甜 王宏亮 邢瑋 吳晏 王偉 張子劍 韓靜

目的 觀察附子對(duì)高糖培養(yǎng)下施萬(wàn)細(xì)胞中Krox20-Oct6途徑及其調(diào)控的髓鞘蛋白的影響，以揭示附子治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制。方法 將施萬(wàn)細(xì)胞分為以下6組：(1)正常組(低濃度葡萄糖)；(2)對(duì)照組(甘露醇)；(3)模型組(高濃度葡萄糖)；(4)附子水提物高、中、低劑量組(10 μg/mL,1.0 μg/mL,0.1 μg/mL)。常規(guī)培養(yǎng)3天后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Oct6、Krox20、髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA的表達(dá)水平，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的Oct6和Krox20蛋白的表達(dá)水平，采用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞的髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白Z蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組中Oct6、Krox20、髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA表達(dá)水平下降；與模型組比，附子水提物各劑量組中Oct6、Krox20、髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA表達(dá)水平上升。Western blot結(jié)果證明，與正常組相比，模型組中Oct6蛋白、Krox20蛋白表達(dá)水平下降；與模型組比，附子水提物各劑量組中Oct6蛋白、Krox20蛋白表達(dá)水平上升。免疫熒光結(jié)果提示，與正常組相比，模型組中髓鞘堿性蛋白蛋白及髓鞘蛋白Z蛋白表達(dá)水平下降；與模型組比，附子水提物各劑量組中髓鞘堿性蛋白蛋白及髓鞘蛋白Z蛋白表達(dá)水平上升。結(jié)論 高濃度葡萄糖通過抑制Krox20-Oct6途徑使施萬(wàn)細(xì)胞髓鞘蛋白生成能力下降，而附子可能通過Krox20-Oct6途徑促進(jìn)髓鞘蛋白的形成，從而改善糖尿病周圍神經(jīng)病變。

糖尿病周圍神經(jīng)病變； 附子； 施萬(wàn)細(xì)胞； Krox20-Oct6信號(hào)通路

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病常見的并發(fā)癥[1]，常見癥狀有神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢和溫度感覺異常，病理特征主要為神經(jīng)軸突萎縮以及髓鞘的受損[2-3]。DPN的作用機(jī)制尚未明確，臨床藥物應(yīng)用具有其自身的局限性，因此亟需探索新的作用機(jī)制以及新的藥物治療方法。

附子為毛茛科多年生草本植物烏頭的子根加工品，味辛、甘、大熱，有毒，具有回陽(yáng)救逆、散寒止痛等功效[4-5]。本課題組前期研究表明附子可以改善糖尿病大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)障礙，縮短糖尿病大鼠的熱板潛伏期[6]，提示附子可能對(duì)DPN具有治療作用，但是其作用機(jī)理尚未得以揭示。施萬(wàn)細(xì)胞是髓鞘形成的一部分，在髓鞘受損時(shí)，施萬(wàn)細(xì)胞進(jìn)行分化，參與髓鞘的再生[7]。生理狀態(tài)下，Krox20-Oct6信號(hào)通路在髓鞘形成過程是核心環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)髓鞘蛋白的生成[8]。本實(shí)驗(yàn)擬觀察在高糖培養(yǎng)下施萬(wàn)細(xì)胞中Krox20-Oct6信號(hào)通路及其調(diào)控的髓鞘蛋白的變化，探討附子對(duì)Krox20-Oct6信號(hào)通路的影響，從而為深入闡述附子的藥理作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及主要試劑

附子飲片(四川江油,編號(hào)20110728)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；0.05%胰蛋白酶(Solarbio公司)；一抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)買于abcam公司；DAPI(Sigma公司)；FITC標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞株

RSC96細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.3 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；核酸蛋白檢測(cè)儀(美國(guó)Quawell公司)；蛋白垂直電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、凝膠圖像分析系統(tǒng)、PCR儀、熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.4 附子單味藥水提物的制備

采用道地產(chǎn)地四川江油附子飲片，取適量置于提取容器中，加入10倍量水，回流提取，過濾，藥渣加8倍量水，回流提取，過濾，合并濾液，濃縮，得到附子水提取物。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)基為含有10%的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(內(nèi)含1%的青霉素和鏈霉素)，培養(yǎng)環(huán)境為5%的CO2，37℃，飽和濕度，2～3天換液一次。

實(shí)驗(yàn)分組：(1)正常組：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(2)對(duì)照組：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 mm甘露醇；(3)模型組：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 mm葡萄糖；(4)附子高劑量組：10 μg/mL附子DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 mm葡萄糖；(5)附子中劑量組：1 μg/mL附子DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 mm葡萄糖；(6)附子低劑量組：0.1 μg/mL附子DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 mm葡萄糖。1.6 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)Oct6、Krox20、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)、髓鞘蛋白Z(myelin protein zero, MPZ)的表達(dá)水平

常規(guī)方法提取RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，使用Nanodrop 2000測(cè)量RNA濃度，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)NCBI GenBank中提供的Oct6、Krox20、MBP和MPZ的mRNA序列，引物序列見表1。按以下反應(yīng)體系：FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) 5μL；DEPC水3.4μL；上游引物0.3μL，下游引物0.3μL；cDNA 1μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：50℃ 2分鐘；95℃ 10分鐘；95℃ 15秒；60℃ 60秒(40個(gè)循環(huán))。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.7 Western blot檢測(cè)Oct6及Krox20蛋白的表達(dá)

細(xì)胞加入RIPA裂解液，充分裂解后，離心取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST(含5%脫脂奶粉)室溫封閉2小時(shí)，TBST漂洗3次，加入一抗4℃孵育過夜；然后TBST漂洗，再加入二抗，室溫2小時(shí)；采用ECL試劑盒檢測(cè)。使用Image Lab軟件分析條帶灰度，采用目的蛋白/β-actin的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 免疫熒光檢測(cè)MBP及MPZ蛋白表達(dá)

制備細(xì)胞爬片，4%的多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100打孔，加入正常血清封閉，滴加適當(dāng)稀釋的抗體，置濕盒中4℃過夜，滴加熒光二抗(1∶50稀釋)，37℃孵育30分鐘，加入DAPI染核5分鐘，蒸餾水終止反應(yīng)，甘油封片。使用激光共聚焦顯微鏡FV1000觀察細(xì)胞，DAPI的激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，發(fā)射波長(zhǎng)488 nm；FITC的激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)519 nm。采用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度，以其他各組相對(duì)于正常組熒光強(qiáng)度的倍數(shù)表示MBP或MPZ的蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 附子對(duì)MBP及MPZ基因及蛋白水平的影響

PCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組MBP基因的含量降低(P<0.05)；同時(shí)，與模型組比較，附子高劑量組MBP基因含量增加(P<0.01)，附子低劑量組MBP基因含量增加(P<0.05)；另外，模型組的MPZ基因含量較正常組降低(P=0.051)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，附子不同劑量組MPZ基因含量較模型組升高(P<0.01)。見表2。

表2 附子對(duì)MBP及MPZ基因表達(dá)水平的影響

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

免疫熒光結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組MBP的蛋白水平表達(dá)降低(P<0.01)，模型組MPZ的蛋白水平表達(dá)降低(P<0.05)；同時(shí)，與模型組比較，附子不同劑量組MBP的蛋白水平表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，附子高劑量MPZ的蛋白水平表達(dá)升高(P<0.05)，附子低劑量組MPZ的蛋白水平表達(dá)升高(P<0.01)。見圖1、2及表3。

2.2 附子對(duì)Krox20及Oct6基因及蛋白水平的影響

PCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Krox20及Oct6的基因的含量降低(P<0.01)；與模型組比較，附子不同劑量組Krox20及Oct6基因的含量增加(P<0.01)。見表4。

圖1 附子對(duì)MBP蛋白表達(dá)水平的影響(免疫熒光，×600)

圖2 附子對(duì)MPZ蛋白表達(dá)水平的影響(免疫熒光，×600)

表3 附子對(duì)MBP及MPZ蛋白表達(dá)水平的影響

注： 與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，

dP<0.01。

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Krox20及Oct6的蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)；與模型組比較，附子高劑量及低劑量組Krox20的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)，附子不同劑量組Oct6蛋白水平表達(dá)均升高(P<0.01)。見圖3及表5。

表4 附子對(duì)Krox20及Oct6基因表達(dá)水平的影響

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

注：A.正常組B.對(duì)照組C. 模型組D.附子高劑量組E.附子中劑組F.附子低劑量組

表5 附子對(duì)Krox20及Oct6蛋白表達(dá)水平的影響

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3 討論

髓鞘是包圍在軸突的膜層結(jié)構(gòu)，主要由施萬(wàn)細(xì)胞組成。它可以保護(hù)軸突并促進(jìn)受損的軸突再生。糖尿病可以引起髓鞘再生受損，進(jìn)一步會(huì)發(fā)生糖尿病周圍神經(jīng)病變。

生理狀態(tài)下，Krox20-Oct6信號(hào)通路是髓鞘形成的關(guān)鍵步驟，是施萬(wàn)細(xì)胞髓鞘化的必要轉(zhuǎn)錄因子[9]。Oct6促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞從前髓鞘化狀態(tài)向髓鞘化轉(zhuǎn)變，Oct6作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控施萬(wàn)細(xì)胞中髓鞘表型相關(guān)標(biāo)記物如MBP、P0和MPZ的表達(dá)[10]。在Oct6敲除小鼠中，坐骨神經(jīng)髓鞘化程度顯著受損，MBP、P0和MPZ水平降低[11]。Krox20促進(jìn)髓鞘化的完成，在髓鞘形成的過程中持續(xù)表達(dá)，參與髓鞘蛋白MBP、P0和MPZ的轉(zhuǎn)錄。在Krox20敲除小鼠中，坐骨神經(jīng)可見脫髓鞘現(xiàn)象，MBP、P0和MPZ水平降低[12]。Oct6和Krox20在髓鞘形成的過程中作用明顯不同[13]，但是又相互依賴，共同調(diào)節(jié)髓鞘的形成。

本研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可造成施萬(wàn)細(xì)胞中Oct6、Krox20、MBP、MPZ蛋白表達(dá)下調(diào)，而附子則可以上調(diào)Oct6、Krox20、MBP、MPZ蛋白表達(dá)，且Oct6、Krox20、MBP、MPZ的基因表達(dá)水平與蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，可以推測(cè)葡萄糖濃度升高時(shí)，Krox20-Oct6信號(hào)通路被抑制，施萬(wàn)細(xì)胞中髓鞘蛋白的合成減少，從而使髓鞘受到損傷，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)障礙或溫度感覺異常。而附子則能通過Krox20-Oct6信號(hào)通路促進(jìn)髓鞘組成成分基因及蛋白的表達(dá)，使髓鞘功能得以改善，從而使神經(jīng)傳導(dǎo)與溫度感知功能得以恢復(fù)。

本研究不僅從髓鞘形成的角度探討了DPN的發(fā)病機(jī)制，為DPN的治療提供了潛在的藥物靶點(diǎn)，而且揭示了附子治療DPN的分子機(jī)制，為后期附子活性物質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯： 禹佳)

Aconiti lateralis radix praeparata on the formation of myelin sheath and the Krox20-Oct6 signaling pathway in Schwann cells induced by high glucose

LVTiantian，WANGHongliang，XINGWei，etal.BasicMedicalCollegeofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

Correspondingauthor:HANJing,E-mail:hanjing8585@163.com

Objective To investigate the Krox20-Oct6 signaling pathway in Schwann cells induced by high glucose and to analyze the effect of aconiti lateralis radix praeparata on the formation of myelin sheath, and then clarify the mechanisms underlying the therapeutic effect of aconiti lateralis radix praeparata in diabetic peripheral neuropathy. Methods Schwann cell were divided into six groups. In the control group, the cells were supplemented with normal cell culture medium. In the mannitol group, the cells were fed with normal glucose plus mannitol. In the model group, the cells were supplemented with high glucose medium. In the other group, the cells were treated with high glucose medium plus different concentrations of aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL). After three days, Real-time PCR was used to detect the expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero mRNA. Western blot was used to detect Oct6 and Krox20 protein expression. Myelin basic protein and myelin protein zero protein expression was detected by immunofluorescence. Results PCR results showed that compared with the control group, the model group showed lower expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero protein. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of Oct6, Krox20, myelin basic protein and myelin protein zero protein. Western blot results indicated that compared with the control group, the model group showed lower expression of Oct6 and Krox20. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata(0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of Oct6 and Krox20. Immunofluorescence results showed that compared with the control group, the model group showed lower expression of myelin basic protein and myelin protein zero protein. In comparison to the model group, aconiti lateralis radix praeparata (0.1 μg/mL, 1.0 μg/mL and 10.0 μg/mL) increased the expression of myelin basic protein and myelin protein zero protein. Conclusion These results indicates that high glucose can decrease the protein of myelin sheath by inhibiting Krox20-Oct6 pathway and that aconiti lateralis radix praeparata improves the diabetic peripheral neuropathy via enhancing the formation of myelin sheath.

Diabetic peripheral neuropathy(DPN); Aconiti lateralis radix praeparata; Schwann cells; Krox20-Oct6 signaling pathway

國(guó)家自然科學(xué)基金(30901959)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題(0100604165)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[呂甜甜(碩士研究生)、王宏亮、邢瑋、吳晏、王偉、張子劍、韓靜]

呂甜甜(1989- )，女，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：糖尿病周圍神經(jīng)及視網(wǎng)膜并發(fā)癥。E-mail：lvtiantian471398@163.com

韓靜(1977- )，女，博士，副研究員。研究方向：糖尿病周圍神經(jīng)及視網(wǎng)膜并發(fā)癥。E-mail：hanjing8585@163.com

R932

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.01.003

2016-03-21)