杜思昊，李冬日，王慧君，王 起

（南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515）

RT-qPCR技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)研究中的應(yīng)用

杜思昊，李冬日，王慧君，王 起

（南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515）

實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）是一種易操作且高效率檢測組織或體液樣本中mRNA的方法，具有操作容易、敏感性高、特異性強等特點。隨著其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，RT-qPCR技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域的研究也得到一定發(fā)展。本文對RT-qPCR技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)科研工作中的應(yīng)用價值及現(xiàn)狀進行綜述，對國內(nèi)外研究進展進行了回顧，并總結(jié)了實驗過程中的檢材提取、RT-qPCR實驗及數(shù)據(jù)處理的注意事項，以期為法醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用提供參考。

法醫(yī)病理學(xué)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；綜述；實時熒光定量

實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）是一項能高通量、高效率檢測目的基因表達水平的技術(shù)。RT-qPCR的主要操作步驟包括總RNA的提取、質(zhì)量檢查、逆轉(zhuǎn)錄、定量PCR及數(shù)據(jù)分析，其主要原理即在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以mRNA為模板合成cDNA的一條鏈，接著在DNA聚合酶的作用下進行擴增，期間通過qPCR儀檢測熒光信號的變化情況并測定目的產(chǎn)物的含量，再根據(jù)標準曲線計算mRNA的含量或與內(nèi)參基因含量比較后計算相對含量[1]。RT-qPCR技術(shù)于1992年由日本科學(xué)家Higuchi提出[2]，因其具有操作簡便、效率高、特異性強等優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等多個領(lǐng)域中。

根據(jù)經(jīng)典遺傳學(xué)中心法則，控制生物遺傳信息的DNA分子需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄形成mRNA、翻譯成多肽鏈，再進一步修飾成為有生物活性的蛋白質(zhì)，因此mRNA的變化早于蛋白的表達變化。目前，RT-qPCR技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)科研方面也獲得了一定發(fā)展。

1 RT-qPCR技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)工作中的應(yīng)用價值與現(xiàn)狀

法醫(yī)病理學(xué)是研究與法律有關(guān)的傷、病、死及死后變化的發(fā)生發(fā)展規(guī)律的一門學(xué)科[3]。其主要工作內(nèi)容即對尸體及器官組織進行檢驗，分析死亡原因，為案件的偵破提供醫(yī)學(xué)證據(jù)。其需要解決的問題包括確定死亡原因、判斷死亡方式、推斷死亡時間、推斷損傷時間、推斷和認定致傷物以及個體識別等。當(dāng)前法醫(yī)病理工作者解決上述問題主要依靠的方法手段是現(xiàn)場勘驗、尸體檢驗、組織病理學(xué)檢驗、毒（藥）物檢驗等，并綜合案情分析得出鑒定意見。而一些致傷因素（如中暑、凍死、中毒）導(dǎo)致的死亡或缺乏典型形態(tài)學(xué)改變的疾?。ㄈ缂毙孕募∪毖?、內(nèi)分泌系統(tǒng)等）導(dǎo)致猝死的鑒定，僅利用傳統(tǒng)的法醫(yī)病理學(xué)方法進行鑒定相對困難。因此，近年來國內(nèi)外學(xué)者將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到法醫(yī)病理學(xué)工作與研究中，利用法醫(yī)尸體解剖時提取的組織和體液等進行RT-qPCR檢測來協(xié)助分析死亡原因、推斷死亡時間、損傷時間等，RT-qPCR技術(shù)正逐漸成為目前法醫(yī)病理學(xué)研究的熱點之一。

1.1 RT-qPCR技術(shù)在死亡原因分析中的應(yīng)用

法醫(yī)病理學(xué)的首要任務(wù)即確定死亡原因，而在一些缺乏特異性形態(tài)學(xué)改變的死亡案件中，若缺乏相關(guān)案情資料，傳統(tǒng)的法醫(yī)病理學(xué)檢查方法有時難以發(fā)現(xiàn)特征性改變[3]。如在急性心肌缺血導(dǎo)致死亡的鑒定中，因缺乏典型的組織病理學(xué)改變，往往給診斷帶來困難。XUE等[4]檢測心肌中Cx43和ZO1的mRNA表達變化，結(jié)果顯示，冠心病猝死組與對照組相比，Cx43和ZO1的mRNA表達明顯降低，提示心臟性猝死者可能發(fā)生心律失常。WANG等[5]檢測肺組織中水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP-1）和 AQP-5的 mRNA 表達變化，發(fā)現(xiàn)AQP-5在窒息組中顯著降低，此改變可能因窒息過程中缺氧引起，有助于對窒息死亡案件進行鑒定。

由于不同案件的死亡原因、機制和過程各不相同，機體組織中分子水平變化也會隨之改變，而常規(guī)組織病理學(xué)檢驗難以發(fā)現(xiàn)這些改變，因此檢測相關(guān)mRNA的變化可以反映死亡機制和過程，輔助進行死亡原因推斷。

1.2 RT-qPCR技術(shù)在推斷死亡時間中的應(yīng)用

死亡時間也稱死后間隔時間（postmortem interval，PMI）。法醫(yī)學(xué)中推斷死亡時間具有十分重要的意義，對于分析案情、劃定偵查范圍、判斷嫌疑人作案時間均有重要價值。但是，實際工作中受個體差異、周圍環(huán)境、死后變化等各因素的影響，準確推斷死亡時間仍是法醫(yī)病理學(xué)的難點。國內(nèi)學(xué)者[6-8]用RT-qPCR技術(shù)檢測死后不同時間大鼠的腦和脾等器官中管家基因GAPDH及β-actin mRNA的水平變化，測定了管家基因在推斷死亡時間中的變化情況，并檢測了不同環(huán)境溫度及濕度下mRNA降解的時序性，為死亡時間的推斷提供了重要數(shù)據(jù)。他們的研究提示，采用管家基因作為推斷死亡時間的研究對象，可以避免選用其他基因帶來的個體差異，并且在腦、脾組織中GAPDH及β-actin mRNA穩(wěn)定性較好，可有效地用于晚期PMI的推斷。呂葉輝等[9]選取12例已知死亡時間的尸體腦組織，通過RT-qPCR技術(shù)檢測8種基因mRNA表達，結(jié)果顯示，利用β-actin mRNA表達推斷PMI的誤差率為24.6%，利用GAPDH mRNA表達推斷PMI的誤差率為41.0%。因此，β-actin mRNA變化與死亡時間相關(guān)性良好，有望成為早期PMI推斷的輔助指標。

1.3 RT-qPCR技術(shù)在推斷損傷時間中的應(yīng)用

法醫(yī)病理學(xué)上的損傷時間是指從受傷到死亡所經(jīng)歷的時間，推斷損傷時間是法醫(yī)病理學(xué)工作的難點與重點，傳統(tǒng)的推斷方法主要是依據(jù)損傷組織的大體形態(tài)和組織病理學(xué)改變。通過多種分子生物學(xué)技術(shù)，可以對損傷修復(fù)過程中特征性的分子水平變化進行研究。例如，在燒傷[10]和切創(chuàng)[11]的損傷時間確定上，均采用RT-qPCR技術(shù)檢測皮膚內(nèi)的細胞因子、趨化因子等標志物。在虐童案件中，皮膚燒傷時間的確定至關(guān)重要，KUBO等[10]研究了燒傷后傷口愈合過程中13個基因表達的時間變化，發(fā)現(xiàn)細胞因子、趨化因子、增殖因子及膠原蛋白等組合能準確估計燒傷年齡。 兔的切創(chuàng)模型中，白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX） 2 及單核細胞趨化蛋白 1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）mRNA在損傷前期有明顯升高，有助于切創(chuàng)早期的時間推斷[11]。國內(nèi)有學(xué)者[12-13]制作大鼠骨骼肌挫傷模型，用RT-qPCR技術(shù)檢測骨骼肌中7種候選基因在不同時間點的mRNA表達水平，顯示其表達水平均與損傷時間有關(guān)；檢測挫傷組織中興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體3（excitatory amino acid transporter 3，EAAT3）、SLC1A1 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)其表達在挫傷后4～8 h升高，隨后逐漸降低，直至48h接近正常水平，說明編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因或執(zhí)行基礎(chǔ)功能的蛋白適用于損傷時間推斷。有研究[14-17]發(fā)現(xiàn)，大鼠肌肉挫傷后組織內(nèi)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、細胞間黏附因子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、COX6C、腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase，ASL）的表達呈時序性變化，有望用于損傷時間推斷。用RT-qPCR技術(shù)檢測大鼠腦挫傷模型mRNA的表達變化特點，發(fā)現(xiàn)caspase-1和caspase-3在挫傷后表達增加，可輔助診斷1h～14d的腦挫傷，而NF-κB只能輔助確定腦挫傷形成時間，但不能作為判斷腦挫傷程度的指標[18-20]。用RT-qPCR技術(shù)檢測小鼠皮膚切創(chuàng)組織的CB2R mRNA變化特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中CB2R的表達變化具有時間規(guī)律性，可為皮膚損傷時間的推斷提供參考[21-22]。除切創(chuàng)、挫傷外，也有學(xué)者[23-25]對脊髓損傷和腦組織缺血模型應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測目的基因的變化，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）基因表達開始升高，對組織和細胞起低氧保護作用。而腦組織缺血后腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）mRNA的表達也呈時間依賴性變化，其表達的時序性規(guī)律有望用于法醫(yī)學(xué)損傷時間推斷。但上述研究主要集中在動物模型，人體組織的驗證較少，其法醫(yī)學(xué)價值尚需進一步挖掘。

1.4 RT-qPCR技術(shù)在推斷死亡過程機體病理生理狀態(tài)中的應(yīng)用

死亡的過程和機制是法醫(yī)病理學(xué)研究的難點，利用RT-qPCR技術(shù)分析尸體組織樣本的mRNA變化來分析死亡當(dāng)時的相關(guān)分子水平情況，從而有助于推斷死亡當(dāng)時的病理生理學(xué)狀態(tài)。RT-qPCR技術(shù)可應(yīng)用于組織損傷的病理學(xué)分析、局部缺血缺氧、中毒或因中毒導(dǎo)致組織損傷部位的炎癥、對暴力或環(huán)境危害的反應(yīng)、中毒繼發(fā)的疾病等分析[26]。例如，CHEN等[27]發(fā)現(xiàn)死后肺質(zhì)量與生存時間相關(guān)；ZHAO等[28]通過RT-qPCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)死后肺組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運體1（glucose transporter 1，GLUT1）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） mRNA 表達量與存活時間相關(guān)，部分說明了死亡當(dāng)時肺的病理生理學(xué)狀態(tài)。WANG等[29]利用RT-qPCR技術(shù)對肺水腫機制進行研究，發(fā)現(xiàn)中暑死亡者的肺組織中基質(zhì)金屬蛋白（matrix metallo protein，MMP）、ICAM-1、緊密連接蛋白（claudin，Cldn）5的表達均升高，而凍死者肺中只有MMP9的表達升高，提示細胞外基質(zhì)破壞、炎癥反應(yīng)、緊密連接改變等多種機制參與中暑死亡者肺水腫的發(fā)生和發(fā)展，而這些分子的變化情況也有助于中暑死亡的輔助診斷。

WANG等[30]研究損傷與肺水腫的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AQP與MMP的mRNA變化情況在外傷與心臟性猝死組的肺組織中有明顯不同，提示不同類型外傷后肺水腫的發(fā)生和發(fā)展機制有差別；他們還研究了燒死者腦水腫的機制，發(fā)現(xiàn)AQP與MMP的mRNA變化情況與燒傷后腦水腫的發(fā)生也存在關(guān)系。CHEN等[31]用RT-qPCR技術(shù)檢測急性心肌缺血心臟組織中腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）與心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟死亡組左心室壁組織中ANP和（或）BNP mRNA的表達更高，顯示心肌鈉尿肽在心肌缺血死亡中的病理生理反應(yīng)特點。因此，檢測不同基因mRNA的表達水平，一方面可以用于分析死亡原因，另一方面也有助于加深法醫(yī)病理學(xué)工作者對死亡過程的理解。

但是RT-qPCR技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)中應(yīng)用依然存在局限性，目前其準確程度尚需進一步驗證。RT-qPCR技術(shù)對樣品要求比較高，但法醫(yī)病理學(xué)尸體檢材往往都存在不同程度的自溶，這也是國內(nèi)外使用RT-qPCR技術(shù)進行研究的對象主要集中于動物模型組織的原因，然而動物模型并不能完全代表人體組織檢材的特點，因此針對RT-qPCR實驗的各環(huán)節(jié)，法醫(yī)病理學(xué)研究有其特殊需要注意的事項。

2 RT-qPCR技術(shù)在法醫(yī)病理學(xué)中應(yīng)用的注意事項

法醫(yī)病理學(xué)檢材由于受死后變化、個體差異、潛在疾病等因素的影響明顯，在應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)時需要特別注意以下問題。

2.1 RT-qPCR技術(shù)對檢材提取的要求

法醫(yī)病理學(xué)鑒定材料主要是尸體組織樣本，尸體腐敗導(dǎo)致mRNA降解。任廣睦等[8]對死后不同時間段大鼠腦組織中的GAPDH mRNA進行檢測，顯示不同腦區(qū)神經(jīng)組織的GAPDH mRNA表達均與死后經(jīng)過時間（死后即刻、1 d、5 d、9 d、12 d）有相關(guān)性；但不同腦區(qū)的mRNA降解速率不同。人體和動物試驗可能存在差異，呂葉輝等[9]對早期死亡的人體腦組織內(nèi)參基因的RNA進行檢測，顯示5S rRNA、miR-9和miR-125b等表達穩(wěn)定，而GAPDH的誤差率較高，可能與死后變化有關(guān)。VAN DEN BERGE等[32]對81例埋藏4～42年的尸體進行不同器官的DNA與RNA分析，發(fā)現(xiàn)DNA和RNA分子均能夠保持較穩(wěn)定的狀態(tài)，其中大腦和心臟組織中RNA最為穩(wěn)定，這一結(jié)果表明，即使是埋藏時間較長的尸體，也有可能進行分子病理學(xué)分析。

提取檢材時應(yīng)考慮后期檢測的需要，盡量多留取。選取對照組時應(yīng)注意詳細審查案情及病歷資料，選取無潛在疾病或藥物干擾的案例。解剖中提取檢材應(yīng)使用潔凈、無污染的器械，提取目標組織樣本，大小不超過0.5cm×0.5cm，需要加入適量組織保存液進行RNA保護[33]。目前常用的組織保存液為RNA later，研究表明RNA later具有更好的保護作用，優(yōu)于冷凍法[33]。

2.2 尸體檢材進行RT-qPCR實驗的注意事項

從檢材中提取出高純度、完整的RNA是RT-qPCR的前提。最常用的RNA提取方法包括Trizol抽提加乙醇沉淀法和試劑盒硅膠膜離心柱法[34-35]。Trizol抽提加乙醇沉淀法可以保留比較完整的RNA分子，但是步驟繁多，容易污染，影響純度；試劑盒硅膠膜離心柱法往往只能留存大分子量的RNA，200nt以下的小分子量RNA容易被漏掉[36]。提取RNA最重要的指標包括濃度、純度和完整度[37]。濃度、純度的控制均按照RT-qPCR實驗的常規(guī)要求；而RNA分子完整性指對RNA進行毛細管電泳時，以軟件中的RNA完整性計數(shù)（RNA integrity number，RIN）進行評估[37]。 在尸體組織樣本中，RIN往往較低，由于RT-qPCR實驗十分靈敏，有少量合格的RNA也可以檢出。

目前最常用于mRNA檢測的熒光技術(shù)是SYBR?Green I和 TaqMan?探針[38-39]。 SYBR?Green I探針需要進行引物設(shè)計、合成、摸索PCR條件等，比較經(jīng)濟實惠；TaqMan?探針操作條件均已得到優(yōu)化，簡便易行，且結(jié)果穩(wěn)定，但價格較貴。在使用SYBR?Green I法進行檢測時，還需要注意溶解曲線的意義及形狀。

2.3 數(shù)據(jù)分析

比較檢材中mRNA的表達差異有絕對定量與相對定量兩種方法。絕對定量即僅依賴Ct值，不考慮擴增效率對結(jié)果的影響。有研究[40-41]發(fā)現(xiàn)，不同樣本的RNA組成不同，個體的逆轉(zhuǎn)錄抑制物差異造成擴增效率不足100%，因此應(yīng)慎重使用絕對定量。相對定量即使用內(nèi)參基因使結(jié)果標準化，從而消除非生物學(xué)變化對結(jié)果的影響。但傳統(tǒng)的內(nèi)參基因并不一定適用于所有的實驗條件，KOPPELKAMM等[42]的研究指出，人體死后組織的內(nèi)參基因建議至少選擇4個以供篩選。WANG等[43]對幾種不同內(nèi)參在尸體材料中表達的情況做過相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗中傳統(tǒng)內(nèi)參基因在法醫(yī)病理學(xué)研究中并不完全適用，須使用多個內(nèi)參基因以提高數(shù)據(jù)分析的準確性。在一項燒傷后腦水腫的分子病理學(xué)研究[29]中，使用不同的內(nèi)參基因進行相對定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用GAPDH或B2M作為內(nèi)參時，AQP和MMP的mRNA水平在燒傷組與對照組中有不同的結(jié)果。XUE等[4]研究發(fā)現(xiàn)，選用傳統(tǒng)的管家基因GAPDH或ACTB與多選擇的幾個管家基因（EEF1A1、PPIA、TPT1和RPL13A）對心肌組織目的基因進行相對定量的結(jié)果也不同。DU等[44]在對甲基苯丙胺中毒死亡尸體組織進行研究，檢測了腦中不同內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，結(jié)果RPL13A、YWHAZ和GUSB用于肺組織的內(nèi)參定量更為穩(wěn)定。因此，尸體檢材用于RT-qPCR時，應(yīng)對不同的器官組織進行內(nèi)參基因的篩選，避免單個內(nèi)參基因造成的相對定量誤差，考慮到時間和效率，建議選取3～4個內(nèi)參基因為宜。

準確定量mRNA的表達豐度不僅需要高靈敏性的檢測方法，而且還需要精確的數(shù)據(jù)分析方法。內(nèi)參的選擇對目的基因的表達矯正具有重要意義。

3 RT-qPCR技術(shù)應(yīng)用前景及展望

當(dāng)前國內(nèi)外法醫(yī)病理學(xué)者使用RT-qPCR技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域依然是mRNA的表達分析，近年來也有學(xué)者開始利用RT-qPCR技術(shù)檢測非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）。李文燦等[45]檢測了大鼠心肌組織中的microRNA、18S rRNA的降解和死亡時間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)microRNA可能與尸體腐敗導(dǎo)致的降解相關(guān)，但在死亡早期（死后120 h）內(nèi)microRNA-1-2含量保持穩(wěn)定，提示死亡早期可以作為一個穩(wěn)定的內(nèi)參指標反映其他生物學(xué)標志物的變化。陳維忠[46]研究了創(chuàng)傷性腦損傷后，大鼠海馬組織microRNA的表達變化與認知功能障礙的相關(guān)性，結(jié)果傷后海馬microRNA表達與P300變化存在一定相關(guān)性，microRNA可能在腦損傷后遺留的認知功能障礙中發(fā)揮調(diào)控作用。有報道[47-50]發(fā)現(xiàn)，不同體液中microRNA的表達特異性也有差異，但是研究體液中microRNA的數(shù)量有限，而且采用不同的檢測方法和分析模型，導(dǎo)致研究的結(jié)果不一致，重復(fù)性差。這些問題可以通過建立復(fù)合檢測體系來解決。隨著RT-qPCR技術(shù)的推廣，相信未來mRNA和ncRNA在法醫(yī)病理學(xué)中的應(yīng)用會更加廣泛。

[1]程強，張新葉，黃敏仁.實時定量RT-PCR技術(shù)及在植物基因表達分析中的應(yīng)用[J].中國生物工程雜志，2005（S1）：82-86.

[2]HIGUCHI R，DOLLINGER G，WALSH P S，et al.Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences[J].Biotechnology （N Y），1992，10（4）：413-417.

[3]從斌.法醫(yī)病理學(xué)[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2016：1-10.

[4]XUE Y，ZHAO R，Du SH， et al.Decreased mRNA levels of cardiac Cx43 and ZO1 in sudden cardiac death related to coronary atherosclerosis： a pilot study[J].Int J Legal Med，2016，130（4）：915-922.

[5]WANG Q， ISHIKAWA T， MICHIUE T， et al.Intrapulmonary aquaporin-5 expression asapossible biomarker for discriminating smothering and choking from sudden cardiac death：a pilot study[J].Forensic Sci Int，2012，220（1-3）：154-157.

[6]劉季，宋貞柱，謝潤紅，等.大鼠死后腦組織RNA降解與死亡時間推斷的研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（4）：226-228，232.

[7]任廣睦，劉季，王英元.實時RT-PCR檢測大鼠死后管家基因 mRNA 的時序性降解[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（1）：33-36.

[8]任廣睦，王英元，劉季.大鼠死后腦組織GAPDH mRNA多位點降解與晚期死亡時間的關(guān)系研究[J].四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2009，40（5）：848-852.

[9]呂葉輝，馬開軍，李志宏，等.人體腦組織RNA表達水平與早期 PMI的相關(guān)性[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（4）：245-249.

[10]KUBO H，HAYASHI T，AGO K，et al.Temporal expression of wound healing-related genes in skin burn injury[J].Leg Med （Tokyo），2014，16（1）：8-13.

[11]BAI R，WAN L，SHI M.The time-dependent expressions of IL-1beta， COX-2， MCP-1 mRNA in skin wounds of rabbits[J].Forensic Sci Int，2008，175（2-3）：193-197.

[12]杜秋香，王小偉，張鐳，等.法醫(yī)病理學(xué)中成傷時間推斷的相關(guān)指標表達（英文）[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（2）：81-84.

[13]杜秋香，宋麗娟，張凌宇，等.大鼠肌肉挫傷組織中SLC1A1 mRNA表達與損傷時間的關(guān)系[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，45（4）：271-274，341.

[14]孫俊紅，杜秋香，王小偉，等.大鼠皮膚挫傷后NF-κB mRNA表達與損傷時間關(guān)系[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（6）：370-373.

[15]孫俊紅，杜秋香，王小偉，等.大鼠皮膚和肌肉挫傷后細胞間黏附分子-1 mRNA表達變化[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（6）：407-410.

[16]孫俊紅，張鐳，王小偉，等.大鼠肌肉挫傷后COX6C mRNA的表達與損傷時間關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（3）：177-180.

[17]孫俊紅，朱細燕，王小偉，等.大鼠肌肉組織挫傷后ASL mRNA表達與損傷時間的關(guān)系[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（4）：376-379.

[18]陶陸陽，陳溪萍，丁梅，等.實驗性腦挫傷后caspase-1表達的研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2003，19（1）：4-7.

[19]陶陸陽，丁梅，陳溪萍，等.大鼠腦挫傷后NF-κB表達的分子生物學(xué)研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2004，20（2）：73-76，80.

[20]陶陸陽，陳溪萍，卞士中，等.大鼠不同程度腦挫傷后caspase-3 表達的研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2004，20（1）：9-12.

[21]鄭吉龍，李曉娜，張山含，等.死后不同時間對小鼠皮膚切創(chuàng)組織中CB2R檢測影響的研究[J].中國刑警學(xué)院學(xué)報，2013（1）：56-59.

[22]鄭吉龍，章學(xué)保，官大威.Real-Time PCR檢測小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中CB2R mRNA變化的時間規(guī)律性研究[J].中國刑警學(xué)院學(xué)報，2016（2）：78-80.

[23]劉楊，韓艷玲，劉季，等.大鼠脊髓損傷后HIF-1α基因的表達[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（1）：4-7.

[24]劉楊，劉季，王亞方，等.大鼠脊髓挫傷后BDNF表達的實驗性研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（1）：15-18.

[25]宋方明，劉雁軍，王英元.大鼠腦組織缺血后Ngb mRNA表達與缺血時間推斷的研究[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，38（4）：289-292.

[26]MAEDA H，ISHIKAWA T， MICHIUE T.Forensic molecular pathology： its impacts on routine work，education and training[J].Leg Med （Tokyo），2014，16（2）：61-69.

[27]CHEN J H， QUAN L， ISHIKAWA T， et al.Postmortem lung weight with regard to survival time[J].Leg Med （Tokyo），2009，11 Suppl 1：S238-S240.

[28]ZHAO D，ISHIKAWA T，QUAN L，et al.Evaluation of pulmonary GLUT1 and VEGF mRNA levels in relation to lung weight in medicolegal autopsy cases[J].Leg Med （Tokyo），2009，11 Suppl 1：S290-S293.

[29]WANG Q，ISHIKAWA T，MICHIUE T，et al.Molecular pathology of brain edema after severe burns in forensic autopsy cases with special regard to the importance of reference gene selection[J].Int J Legal Med，2013，127（5）：881-889.

[30]WANG Q，ISHIKAWA T，MICHIUE T， et al.Molecular pathology of pulmonary edema after injury in forensic autopsy cases[J].Int J Legal Med，2012，126（6）：875-882.

[31]CHEN J H， MICHIUE T， ISHIKAWA T， et al.Pathophysiology of sudden cardiac death as demonstrated by molecular pathology of natriuretic peptides in the myocardium[J].Forensic Sci Int，2012，223（1-3）：342-348.

[32]VAN DEN BERGE M，WISKERKE D，GERRETSEN R R，et al.DNA and RNA profiling of excavated human remains with varying postmortem intervals[J].Int J Legal Med，2016，130（6）：1471-1480.

[33]路俊鋒，陳宏，吳勁松，等.不同保存方法對腦膠質(zhì)瘤和其周邊組織RNA保存的研究[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2010，18（2）：199-202.

[34]CHOMCZYNSKI P，SACCHI N.Thesingle-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction：twenty-something years on[J].Nat Protoc，2006，1（2）：581-585.

[35]MASOTTI A，CAPUTO V，DA S L，et al.Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles[J].J Biomed Biotechnol，2009，2009：659028.

[36]崔山佳，羅明富，張金玲.家兔脂肪組織總RNA提取方法的比較[J].解剖科學(xué)進展，2010，16（1）：48-50.

[37]MANJU SETHI.一種確保qPCR和RT-qPCR實驗成功的方法[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2011（2）：36-39.

[38]趙友云，高應(yīng)林，王春香，等.SYBR Green I聯(lián)合Taq-Man熒光定量PCR檢測HBV-DNA的意義[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2007，7（6）：575-577.

[39]ZHOU X，ZHANG T，SONG D，et al.Comparison and evaluation of conventional RT-PCR，SYBR green I and TaqMan real-time RT-PCR assays for the detection of porcine epidemic diarrhea virus[J].Mol Cell Probes，2017，33：36-41.

[40]KARLEN Y，MCNAIR A，PERSEGUERS S，et al.Statistical significance of quantitative PCR[J].Bmc Bioinformatics，2007，8：131.

[41]PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Res，2001，29（9）：e45.

[42]KOPPELKAMM A，VENNEMANN B，F(xiàn)RACASSO T，et al.Validation of adequate endogenous reference genes for the normalisation of qPCR gene expression data in human post mortem tissue[J].Int J Legal Med，2010，124（5）：371-380.

[43]WANG Q，ISHIKAWA T，MICHIUE T，et al.Stability of endogenous reference genes in postmortem human brains for normalization of quantitative realtime PCR data： comprehensive evaluation using geNorm， NormFinder，and BestKeeper[J].Int J Legal Med，2012，126（6）：943-952.

[44]DU Y，JIN H N，ZHAO R，et al.Molecular pathology of pulmonary edema in forensic autopsy cases with special regard to fatal methamphetamine intoxication[J].J Forensic Sci，2016，61（6）：1531-1537.

[45]李文燦，馬開軍，張萍，等.大鼠心肌組織中microRNA和18S rRNA的降解與死亡時間的相關(guān)性[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（6）：413-417.

[46]陳維忠.顱腦損傷后大鼠認知功能障礙與海馬micro-RNA表達初步研究[D].華中科技大學(xué)，2011.

[47]COURTS C，MADEA B.Specific micro-RNA signatures for the detection of saliva and blood in forensic body-fluid identification[J].J Forensic Sci，2011，56（6）：1464-1470.

[48]HANSON E K，LUBENOW H，BALLANTYNE J.Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs[J].Anal Biochem，2009，387（2）：303-314.

[49]WANG Z，ZHANG J， LUO H， et al.Screening and confirmation of microRNA markers for forensic body fluid identification[J].Forensic Sci Int Genet，2013，7（1）：116-123.

[50]ZUBAKOV D，BOERSMA A W，CHOI Y，et al.MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation[J].Int J Legal Med，2010，124（3）：217-226.

2016-11-07）

（本文編輯：黃 平）

Application of RT-qPCR in the Study of Forensic Pathology

DU Si-hao,LI Dong-ri,WANG Hui-jun,WANG Qi
（School of Forensic Medicine,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China）

Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-qPCR） is a convenient and highly efficient method for the detection of mRNA in tissues or body fluid samples.It has the characteristics of easy operation,high sensitivity and specificity,etc.With a wide application in medicine,biology and other fields,RT-qPCR technique has made some progresses in the research field of forensic pathology.This paper reviews the application value of RT-qPCR in the study of forensic pathology and current situation,as well as the research progress at home and abroad reviews.It also summarizes the notes of samples extraction,RT-qPCR experiments and data processing,which aims to provide reference for the forensic research and its application.

forensic pathology;reverse transcriptase polymerase chain reaction;review;real-time quantification

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.017

1004-5619（2017）05-0526-06

國家自然科學(xué)基金資助項目（81401556）；廣東省自然科學(xué)基金資助項目（2014A030310293）

杜思昊（1992—），男，博士，主要從事法醫(yī)病理學(xué)科研、鑒定；E-mail：sihaodu@foxmail.com

王起，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)學(xué)教學(xué)、科研和鑒定；E-mail：wangqi_legmed@126.com