趙亞飛+高楊+吳欣芳+王建剛+段冷昕

[摘要]該研究旨在探討蚯蚓活性組分（EWAs）對四氯化碳（CCl4）誘導小鼠內質網(wǎng)應激（ERS）所致急性肝損傷的保護作用。腹腔注射10%CCl4制備內質網(wǎng)應激所致急性肝損傷模型；血清生化指標檢測ALT，AST，SOD，GSHPX酶活性及MDA含量變化；計算肝、脾指數(shù)；HE染色觀察肝臟病理學變化；TUNEL法檢測肝組織細胞凋亡情況；免疫組織化學法檢測ERS標志性蛋白GRP78和CHOP表達情況；Western blot法檢測ERS相關蛋白的表達水平。結果顯示，與模型組小鼠相比，EWAs的高、中、低劑量組血清學各項指標均有顯著改善（P<005或P<001），肝臟病變范圍減小，且損傷程度明顯減輕，小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均有明顯變化（P<005或P<001）；各劑量給藥組的肝組織細胞凋亡指數(shù)明顯下降（P<005或P<001）；肝組織中ERS相關蛋白GRP78和CHOP表達水平顯著降低（P<005或P<001），各劑量給藥組均能顯著下調GRP78和CHOP以及CHOP上游信號通路PERKeIF2αATF4的蛋白表達（P<005或P<001）。綜上，EWAs對ERS所致的小鼠急性肝損傷具有顯著保護作用，其機制可能通過抑制氧化應激和ERS，從而減輕肝臟損傷，并可下調ERS標志性凋亡蛋白CHOP表達，抑制細胞凋亡實現(xiàn)的。

[關鍵詞]蚯蚓活性組分； 內質網(wǎng)應激； 肝損傷； GRP78； CHOP

[Abstract]To study the protective effect of earthworm active ingredients（EWAs） against endoplasmic reticulum stress（ERS）induced acute liver injury in mice. The model of liver injury was induced through intraperitoneal injection of 10%CCl4. Serum glutamicpyruvic transaminase（ALT）， glutamicoxaloacetic transaminase（AST）， superoxide dismutase（SOD） and glutathione peroxidase（GSHPX） activity and malondialdehyde（MDA） concentration were detected by colorimetric method. Histological examination was performed through hematoxylineosin staining and light microscopy， and apoptosis was detected using terminal transferase dUTP nick end labeling. The expressions of ERS related proteins， including glucose regulated protein 78（GRP78）， protein kinase Rlike ER kinase（PERK）， eukaryotic transcription initiation factor 2α（eIF2α）， active transcription factor4（ATF4） and CCAAT/enhancer binding homologous protein（CHOP）， were measured by immunohistochemistry and Western blot. According to the results， compared with the model group，serological indexes in the high， middle and low doses of EWAs were significantly improved （P<0.05 or P<0.01）， the extent of liver lesion was decreased and the degree of injury was significantly reduced， and that the liver index and the spleen index of mice were significantly changed（P<0.05 or P<0.01）. In liver tissue， the expressions of GRP78 and CHOP were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）. The protein expressions of GRP78， CHOP and its upstream signaling pathway PERKeIF2ATF4 were significantly decreased in each dose group（P<0.05 or P<0.01）. In summary， EWAs has a significant protective effect on ERSinduced acute liver injury， and its mechanism may be correlated with the inhibition of oxidative stress and ERS， and downregulation of ERS marker protein CHOP expression， andinhibition of apoptosis.

[Key words]EWAs； ERS； liver injury； GRP78； CHOP

肝臟疾病是影響人類健康最為常見的疾病之一，從傳統(tǒng)中藥或食物中尋找有效部位或有效成分治療肝臟疾病已成為目前研究的熱點[1]。蚯蚓是一種平肝潛陽的傳統(tǒng)中藥，《神農本草經(jīng)》上記載該藥性味咸、寒，歸肝、脾、膀胱經(jīng)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓具有調節(jié)免疫系統(tǒng)、肝臟和腎臟功能、心血管系統(tǒng)、抗腫瘤和抗氧化作用等[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓活性組分（earthworm active ingredients，EWAs）對衣霉素誘導的內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）所致的L02細胞（人正常肝細胞系）損傷具有顯著的保護作用，可以促進受損細胞的增殖，減輕ERS，抑制ERS所介導的細胞凋亡[3]。本研究旨在探討EWAs對四氯化碳（CCl4）誘導小鼠ERS所致急性肝損傷是否有保護作用及其可能作用機制。

1材料

11藥品與試劑EWAs是本實驗室由新鮮冰凍蚯蚓（赤子愛勝蚯蚓）獲得[4]，儲存于-20 ℃，黃白色絮狀物，易溶于水，含多肽（75%），多糖（17%），維生素D和無機鹽（如鈣和磷）；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；TUNEL試劑盒（美國Roche公司）；兔IgG免疫組化試劑盒（博士德生物工程有限公司）；雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶（protein kinase Rlike ER kinase，PERK）、活化轉錄因子 4（active transcription factor4，ATF4）抗體（美國Santa Cruz公司）；真核轉錄起始因子2α（eukaryotic transcription initiation factor 2α，eIF2α），CCAAT/增強子結合蛋白（CCAAT/enhancer binding homologousprotein，CHOP）抗體（美國Proteintech Group公司）；葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）抗體（美國Abcam公司）。

12動物清潔級健康昆明種小鼠，雄性，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK（鄂）20100007。

2方法

21急性肝損傷模型建立及給藥方案將50只健康雄性小鼠隨機分為5組，正常組、模型組、EWAs低劑量組（EWAsL，3 mg·kg-1·d-1）、EWAs中劑量組（EWAsM，6 mg·kg-1·d-1）、EWAs高劑量組（EWAsH，12 mg·kg-1·d-1）。實驗前適應性喂養(yǎng)1周。正常組和模型組每天皮下注射等體積生理鹽水，給藥組皮下注射不同劑量EWAs，連續(xù)10 d。末次給藥8 h后，除正常組外，其余組腹腔注射10%CCl4[5]大豆油溶液（001 mL·g-1），禁食不禁水，24 h后，摘眼球取血，脫臼處死，摘取肝臟及脾臟，稱重。

22生化指標檢測摘眼球取血，離心（3 000 r·min-110 min），取血清，按照相關試劑盒說明測定ALT，AST，MDA，GSHPX和SOD含量。

23肝臟、脾臟指數(shù)計算肝臟指數(shù)（mg·g-1）=肝臟質量（mg）/體重（g），脾臟指數(shù)（mg·g-1）=脾臟質量（mg）/體重（g）。

24HE及免疫組織化學染色取肝臟組織相同部位固定于10%甲醛溶液中，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色后，光學顯微鏡下觀察組織病理變化。免疫組織化學染色程序：脫蠟，水化，3%H2O2室溫孵育10 min，熱抗原修復每次10 min（重復3次），5%BSA封閉30 min（37 ℃恒溫箱），一抗4 ℃過夜孵育：GRP78（1∶250），CHOP（1∶50），PBS洗3遍（每次5 min），二抗孵育30 min（37 ℃恒溫箱），PBS洗，DAB顯色，蘇木精復染45 s，脫水，透明，封片，拍照。利用Image Pro Plus 60軟件對染色結果進行分析處理。

25肝組織細胞凋亡檢測采用TUNEL法檢測肝臟細胞的凋亡情況，以細胞核呈棕褐色為陽性染色。肝組織切片厚度4 μm，脫蠟、水化；蛋白酶K通透30 min（37 ℃恒溫箱）；PBS漂洗3次，加TUNEL反應混合液（TdT熒光素標記的dUTP 1∶9）進行標記反應，37 ℃恒溫箱中孵育30 min；DAB顯色，脫水，透明，封片。結果處理：在光學顯微鏡（×400）下隨機選取5個不同的視野，分別計數(shù)其中的總的細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)，然后計算凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

26Western blot法檢測肝組織GRP78和CHOP 及其上游通路PERKeIF2αATF4表達情況稱取肝臟組織1 g，加入1 mL細胞裂解液，研磨提取總蛋白，冰浴30 min，4 ℃離心（12 000 r·min-110 min）取上清，測定蛋白含量（BCA法）。取100 μg蛋白樣品進行SDSPAGE電泳，轉膜（400 mA，90 min），5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育：GRP78（1∶1 000），CHOP（1∶500），PERK（1∶200），eIF2α（1∶200）和ATF4（1∶200），二抗孵育1 h（室溫），暗室中ECL發(fā)光液顯色，掃描結果。用GelPro Analyzer分析其灰度值，經(jīng)βactin結果校正后，比較各組相對灰度值。

27統(tǒng)計學分析采用SPSS 170統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，結果用±s表示，不同組間采用單因素方差分析，P<005為有統(tǒng)計學意義。

3結果

31EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠血清學指標影響與正常組相比，模型組小鼠血清中ALT和AST水平及其MDA含量顯著升高（P<001），SOD和GSHPX活性顯著降低（P<001）。與模型組相比，EWAs低、中、高各劑量組小鼠血清中ALT和AST水平及其MDA含量均明顯降低（P<005或P<001），SOD和GSHPX活性顯著升高（P<001），且具有劑量依賴性，見表1。

32EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)影響模型組較正常組肝臟指數(shù)明顯增高（P<001），脾臟指數(shù)顯著減?。≒<001），與模型組相比，高、中、低劑量組各項指標均有顯著改善，具有統(tǒng)計學意義（P<005或P<001），見表2。

33EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織病理學變化影響正常組小鼠肝組織中肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉結構正常，模型組小鼠肝臟腫大，胞質疏松，出現(xiàn)明顯的片狀壞死和氣球樣變，高、中、低給藥組小鼠肝臟病變范圍減小，且損傷程度隨著藥物濃度的增大而逐步減輕，見圖1。

34EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝臟細胞凋亡情況的影響正常組小鼠肝臟細胞無明顯凋亡，而模型組小鼠肝臟細胞大量凋亡，凋亡指數(shù)明顯增高（P<001）。與模型組相比，各給藥組小鼠肝臟細胞凋亡指數(shù)均顯著降低（P<005或P<001），見圖2。

35EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織中GRP78和CHOP表達情況影響模型組ERS標志性蛋白GRP78和CHOP表達水平顯著升高（P<001），中、高劑量組中GRP78蛋白顯著降低（P<001），見圖3，CHOP表達顯著下調（P<001），見圖4。

36EWAs對ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織中ERS相關蛋白表達水平影響模型組ERS標志性蛋白GRP78，CHOP及上游信號通路PERKeIF2αATF4表達水平顯著升高（P<001），各給藥組的ERS相關蛋白因子PERK，GRP78和eIF2α表達水

A正常組；B模型組；CEWAsL；DEWAsM；EEWAsH（圖2～5同）。

與正常組相比1）P<005，2）P<001；與模型組相比3）P<005，4）P<001（圖3～5同）。

平均降低，呈一定劑量依賴性，具有統(tǒng)計學意義（P<005或P<001），中、高劑量組中ATF4和CHOP蛋白表達顯著降低（P<001），見圖5。

4討論

研究發(fā)現(xiàn)EWAs作為一種新型的保肝藥物，其主要成分是相對分子質量在20 kDa以下的小肽類物質，因此選擇皮下注射的給藥方式。根據(jù)EWAs的急性毒性實驗結果確定該給藥方式下的高、中、低給藥劑量。預先給EWAs 10 d，腹腔注射CCl4建立內質網(wǎng)應激所致急性肝損傷模型，繼續(xù)給藥1 d，24 h處死小鼠，取樣。病理學結果顯示高劑量組未使肝臟損傷恢復到正常水平，可能是損傷后給藥時間過短。

CCl4是一種誘導肝臟損傷的經(jīng)典化學物質，所致的肝細胞損傷使細胞膜結構和功能發(fā)生改變，產生活性氧攻擊內質網(wǎng)[6]，導致過氧化和錯誤折疊蛋白質在內質網(wǎng)腔中堆積，誘導ERS[7]，降低抗氧化

能力，導致自由基增加，從而破壞細胞結構和功能，最終導致細胞死亡[8]。本實驗中，模型組小鼠血清中 ALT，AST，MDA含量均顯著升高，而SOD，GSHPX酶活性明顯降低，提示小鼠體內抗氧化能力明顯下降，可能發(fā)生了氧化應激，出現(xiàn)了急性的肝組織損傷。而給予EWAs治療的小鼠各項指標均有了顯著改善，這也提示EWAs在動物體內具有顯著的抗氧化作用，可能通過減輕氧化應激損傷發(fā)揮其保護作用。

正常生理情況下，GRP78作為一種重要分子伴侶結合蛋白，與內質網(wǎng)膜上感受態(tài)蛋白PERK、激活作用轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、肌醇酶1α（inositolrequiring enzyme1α，IRE1α）相結合，形成復合物，使感受態(tài)蛋白處于未活化狀態(tài)。致病因子作用下，GRP78從感受態(tài)蛋白上解離，識別和結合內質網(wǎng)腔積累的未折疊蛋白，啟動一系列細胞內信號轉導反應，誘導ERS[9]。強烈

或長時間的ERS，使機體內GRP78高度表達，因此GRP78的表達水平可以作為ERS發(fā)生的標志之一[10]。ERS發(fā)生時，GRP78從感受態(tài)蛋白上解離，從而使PERK，ATF6和IRE1這3個膜感受態(tài)蛋白活化，進而激活由這3個蛋白介導的信號通路，啟動下游凋亡因子CHOP的表達[11]，其中PERKeIF2αATF4途徑是啟動CHOP表達所必須的[12]，且活性強于其他通路[13]。本實驗中，重點探討了CCl4誘導的小鼠肝細胞ERS時，GRP78和CHOP[14]以及其上游的PERKeIF2αATF4通路蛋白表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織中GRP78和CHOP蛋白水平明顯升高，且CHOP上游的PERKeIF2αATF4通路蛋白表達也均顯著上調，提示模型組小鼠肝組織可能發(fā)生了ERS時CHOP介導的細胞凋亡，TUNEL實驗結果也證明有大量肝臟組織細胞凋亡。而EWAs給藥組的各項指標均有了明顯的改善，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，因此，EWAs對CCl4誘導小鼠ERS所致急性肝損傷的保護作用可能與其下調PERKeIF2αATF4通路蛋白表達，繼而減少CHOP表達，抑制CHOP介導的細胞凋亡，減輕ERS有關。

綜上，本研究初步探討了蚯蚓活性組分對CCl4誘導小鼠ERS所致急性肝損傷的保護作用及可能作用機制，為深入研究急性肝損傷發(fā)生機制提供了新的參考，也為蚯蚓活性組分最終作為一類保肝藥物在臨床上應用奠定了實驗基礎。

[參考文獻]

[1]Chen Wei，He Ying，Jiang Dingwen，et alProtective effect of Fomes fomentarius extracts on CCl4induced acute liver injury in mice[J]Lishizhen Med Mater Med Res，2013，24（3）：605

[2]祝未名中藥地龍的活性成分與藥理作用研究[J]海峽藥學， 2013，25（4）：25

[3]Wang Q， Duan L X， Xu Z S，et alThe protective effect of the earthworm active ingredients on hepatocellular injury induced by endoplasmic reticulum stress[J]Biomed Pharmacother， 2016，82：304

[4]河南科技大學 一種蚯蚓提取物及其提取方法和應用：中國， 2012100146536[P] 20120116

[5]黎永華，陶力內質網(wǎng)應激在小鼠急性肝損傷中的作用機制[J]廣東醫(yī)學，2015，36（1）：35

[6]Marumoto Y，Terai S， Urata Y，et al Continuous high expression of XBP1 and GRP78 is important for the survial of bone marrow cells in CCl4treated cirrhotic liver[J]Biochem Biophys Res Commun， 2008， 367（3）：546

[7]Ryusuke Akihara，Takujiro Homma， Jaeyong Lee， et alAblation of aldehyde reductase aggravates carbon tetrachlorideinduced acute hepatic injury involving oxidative stress and endoplasmic reticulum stress[J]Biochem Biophy Res Commun，2016，478（2）： 765

[8]Afzal M，Khan R，KazmiI，et alHepatoprotective potential of new steroid against carbon tetrachlorideinduced hepatic injury[J].Mol Cell Biochem，2013， 2： 355

[9]Parmar V M， Schroder M Sensing endoplasmic reticulum stress[J]Adv Exp Med Biol， 2012， 738：153

[10]Schnthal A H Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stresssignaling incancer[J]Biochem Pharmacol， 2013，85： 653

[11]Rozpdek W， Pytel D，Mucha B The role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP signaling pathway in tumor progression during endoplasmic reticulum stress[J]Author Manuscript， 2016，16（6）： 533

[12]Yang ShuangYan， Wei FuLan， Hu LiHua，et alPERKeIF2αATF4 pathway mediated by endoplasmic reticulum stress response is involved in osteodifferentiation of human periodontal ligament cells under cyclic mechanical force[J]Cell Signal， 2016，28：880

[13]Rao J， Zhang C， Wang P，et alC/EBP homologous protein （CHOP） contributes to hepatocyte death via the promotion of ERO1α signalling in acute liver failure[J]Biochem， 2015， 466（2）：369

[14]Chen L， Ren F， Zhang H， et al Inhibition of glycogen synthase kinase 3β ameliorates DGalN/LPSinduced liver injury by reducing endoplasmic reticulum stresstriggered apoptosis[J] PLoS ONE， 2012，7（9）：e45202

[責任編輯張寧寧]