王華華++李焱++候俊杰

摘要：以擬南芥野生型、一氧化氮（NO）產(chǎn)生途徑相關(guān)突變體Atnoa1（NO合成酶缺失突變體）和nialnia2（硝酸還原酶缺失突變體）為材料，研究鋁毒害對(duì)擬南芥野生型、Atnoa1和nialnia2的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度（0～200 μmol/L）AlCl3處理抑制了擬南芥中根的生長(zhǎng)，野生型和Atnoa1突變體表現(xiàn)出一致的抑制趨勢(shì)，而nialnia2突變體中根生長(zhǎng)的抑制程度更嚴(yán)重。進(jìn)一步的結(jié)果顯示，AlCl3處理增加了擬南芥中丙二醛和活性氧（H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]）含量，野生型和Atnoa1突變體表現(xiàn)出一致的增加趨勢(shì)，而nialnia2突變體中丙二醛和活性氧含量增加幅度更大；此外，AlCl3處理顯著增加了擬南芥中還原型抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的含量，野生型和Atnoa1突變體表現(xiàn)出一致的增加趨勢(shì)，而nialnia2突變體中AsA和GH含量增加幅度最小。這些結(jié)果表明，硝酸還原酶途徑介導(dǎo)的NO在增強(qiáng)植物抗鋁毒害過(guò)程中起著重要的作用。

關(guān)鍵詞：一氧化氮；鋁毒害；硝酸還原酶；一氧化氮突變體；耐受性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0465-03

收稿日期：2016-02-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31301252）；河南師范大學(xué)優(yōu)秀青年科學(xué)基金（編號(hào)：14YQ003）；河南師范大學(xué)博士啟動(dòng)課題（編號(hào)：11129）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（編號(hào)：15IRTSTHN020）。

作者簡(jiǎn)介：王華華（1980—），男，湖北漢川人，博士，副教授，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：hhwang04@163.com。

鋁毒害是酸性土壤中限制植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量的主要因子[1]。植物遭受鋁毒害最顯著的1個(gè)特征就是根生長(zhǎng)受到抑制，根尖是鋁毒害的作用位點(diǎn)。當(dāng)土壤pH值降低到5.5以下后，鋁以毒害的形式進(jìn)入到土壤溶液中抑制根系生長(zhǎng)，從而阻礙植物對(duì)水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受抑制和作物產(chǎn)量下降[2]。因此，增強(qiáng)作物鋁耐受性是提高酸性土壤中作物產(chǎn)量的一個(gè)關(guān)鍵因素，有利于解決食物短缺和生物能源生產(chǎn)這一難題。

研究發(fā)現(xiàn)，鋁毒害會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的過(guò)量產(chǎn)生，從而造成氧化脅迫傷害[3]。為了避免活性氧的過(guò)量積累，植物體內(nèi)也形成了多種清除活性氧的機(jī)制，除了酶促抗氧化機(jī)制[如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等]外，還存在非酶促抗氧化機(jī)制[如還原型抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）等][4]。AsA、GSH是清除活性氧的2種重要抗氧化物質(zhì)，二者含量的高低與植物的抗逆性密切相關(guān)[5]。有報(bào)道表明，維持轉(zhuǎn)基因植株中高水平的AsA和GSH含量可以增強(qiáng)植物對(duì)脅迫的耐受性[6]。但是對(duì)于鋁脅迫下抗氧化機(jī)制的信號(hào)調(diào)節(jié)仍有待進(jìn)一步研究。

一氧化氮（NO）是一種重要的信號(hào)分子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和多種環(huán)境脅迫響應(yīng)[7]。植物體內(nèi)有2條重要的產(chǎn)生NO的潛在途徑：NO合成酶（NOS）和硝酸還原酶（NR）所介導(dǎo)的酶促途徑[8]。擬南芥NO的相關(guān)突變體Atnoa1（NOS缺失突變體）和nialnia2（NR缺失突變體）現(xiàn)已廣泛用來(lái)研究NO在植物中的生理功能，Atnoa1和nialnia2突變體表現(xiàn)為NO的積累減少。2種突變體均是由于NO產(chǎn)生途徑中關(guān)鍵酶的基因發(fā)生突變，使得2種突變體的NO產(chǎn)生量少于野生型，為從遺傳學(xué)的角度揭示NO在鋁毒害中的作用提供了良好的材料。前期研究結(jié)果表明，NO可增強(qiáng)植物對(duì)鋁毒害的耐受性[9]，但有關(guān)NO與植物抗鋁毒害的關(guān)系研究主要是通過(guò)運(yùn)用外源NO供體、NO合成酶抑制劑、NO清除劑等獲得的藥理學(xué)證據(jù)，還未有更直接的遺傳學(xué)證據(jù)表明NO在鋁毒害中產(chǎn)生的作用以及鋁毒害下NO的產(chǎn)生來(lái)源。本研究以NO相關(guān)突變體Atnoa1和nialnia2為材料，從遺傳學(xué)角度進(jìn)一步探討NO在鋁脅迫下植物耐受性的作用。

1材料與方法

1.1供試材料

擬南芥野生型（WT，Col-0型）、Atnoa1（NO合成酶缺失）和nialnia2（硝酸還原酶缺失）突變體植株。

1.2材料培養(yǎng)

首先將擬南芥種子用10%次氯酸鈉消毒15 min，然后用無(wú)菌水清洗3次，再將種子點(diǎn)播在含3%蔗糖、0.8%瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基（pH值=5.7）上。4 ℃春化3 d后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至培養(yǎng)間垂直放置生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件：22 ℃、14 h光周期[光照度120 μmol/（m2·s）]、相對(duì)濕度為70%。

1.3材料處理

將生長(zhǎng)10 d的擬南芥幼苗輕輕地從瓊脂板上移出避免傷害到根，然后轉(zhuǎn)移到含有不同濃度（0、25、50、100、200 μmol/L）AlCl3的1/2 MS培養(yǎng)基（pH值=4.5）瓊脂板上培養(yǎng)處理3 d。處理完畢后，將苗用蒸餾水洗凈后用于參數(shù)測(cè)定分析。

1.4測(cè)定方法

處理完成后收集擬南芥幼苗用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。根相對(duì)伸長(zhǎng)量的測(cè)定，用相機(jī)對(duì)處理后的擬南芥根部進(jìn)行拍照，根長(zhǎng)用ImageJ軟件進(jìn)行分析，每個(gè)處理至少分析30條。丙二醛、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]含量測(cè)定參照Wang等的方法[9]；AsA和GSH的測(cè)定參照de Pinto等的方法[10]進(jìn)行。當(dāng)粗提液中不加入二硫蘇糖醇時(shí)，此時(shí)測(cè)得的數(shù)值為還原型AsA的含量。GSH的含量是總的谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的差值；所測(cè)指標(biāo)測(cè)定時(shí)至少重復(fù)3次，取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1不同AlCl3濃度處理對(duì)野生型、Atnoa1和nialnia2突變體根生長(zhǎng)的影響

根生長(zhǎng)抑制是植物遭受鋁毒害最為顯著的一個(gè)特征。為檢測(cè)擬南芥對(duì)鋁脅迫的敏感性，本研究檢測(cè)不同鋁濃度（0～200 μmol/L）[JP2]對(duì)根生長(zhǎng)的影響。如圖1所示，在無(wú)鋁處理的培養(yǎng)基中，所有供試材料的根系生長(zhǎng)均正常。鋁處理?xiàng)l件下，隨著鋁濃度增大，所有植株的根系伸長(zhǎng)均呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系抑制。野生型和Atnoa1突變體的根長(zhǎng)變化趨勢(shì)相似，而nialnia2突變體的根系生長(zhǎng)抑制程度更為明顯。例如，當(dāng)用濃度為 100 μmol/L 的AlCl3處理后，野生型、Atnoa1突變體和nialnia2突變體根長(zhǎng)抑制率分別達(dá)到41.7%、45.8%和 74.8%。這些結(jié)果說(shuō)明nialnia2突變體比野生型表現(xiàn)出對(duì)鋁更敏感。

2.2鋁脅迫對(duì)野生型、Atnoa1和nialnia2突變體中MDA和活性氧含量的影響

MDA和活性氧含量是衡量氧化脅迫程度的2個(gè)重要指標(biāo)。為了查明鋁毒害誘導(dǎo)的根生長(zhǎng)抑制是否由于遭受氧化傷害所導(dǎo)致，本研究檢測(cè)了鋁脅迫對(duì)MDA和活性氧含量的影響。如圖2、圖3、圖4所示，在無(wú)鋁培養(yǎng)基中，所有供試材料中丙二醛（MDA）和活性氧（H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]）含量均無(wú)顯著差異。50 μmol/L的AlCl3處理下，擬南芥中MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量均顯著增加，野生型和Atnoa1突變體表現(xiàn)出一致的增加趨勢(shì)，而nialnia2突變體中MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]含量增加幅度更大。在野生型中，鋁脅迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比對(duì)照分別增加39.3%、48.8%和58.3%；在Atnoa1突變體，鋁脅迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比對(duì)照分別增加417%、48.4%和60.0%；在nialnia2突變體中，鋁脅迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比對(duì)照分別增加了 103.2%、1216%和113.7%。這些結(jié)果也說(shuō)明nialnia2突變體比野生型受到了更為嚴(yán)重的氧化脅迫傷害。

2.3鋁脅迫對(duì)野生型、Atnoa1和nialnia2突變體中AsA和GSH含量的影響

還原型抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）是體內(nèi)2種重要的小分子抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)過(guò)量活性氧，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)，從而避免細(xì)胞遭受氧化傷害。為進(jìn)一步查明鋁脅迫下nialnia2突變體比野生型對(duì)鋁更敏感以及遭受更嚴(yán)重的氧化傷害的原因，本研究檢測(cè)了鋁對(duì)AsA和GSH含量的影響。如圖5、圖6所示，在野生型和突變體對(duì)照植株中，AsA和GSH含量均無(wú)明顯差異。50 μmol/L AlCl3處理下，擬南芥中AsA和GSH的含量均顯著增加，野生型和Atnoa1突變體均表現(xiàn)出類(lèi)似的增加趨勢(shì)，而nialnia2突變體中AsA和GSH含量增加幅度最小。鋁脅迫下，野生型、Atnoa1突變體和nialnia2突變體中AsA增加量分別達(dá)到72.5%、73.6%和22.6%，GSH增加量分別達(dá)到41.8%、45.1%和17.0%。這些結(jié)果說(shuō)明鋁脅迫下nialnia2突變體中AsA和GSH含量增加幅度最小，其清除活性氧的能力也最弱。

3結(jié)論與討論

[JP2]鋁毒害會(huì)引起植物一系列生理生化進(jìn)程的改變，從而導(dǎo)致植物根的生長(zhǎng)及其功能受到抑制，最終造成作物減產(chǎn)。然而，所幸的是植物在遭受鋁毒害時(shí)，不同的植物體內(nèi)可形成不同的耐受鋁毒害的機(jī)制[11]。有大量研究表明，NO作為信號(hào)分子參與了多種環(huán)境脅迫響應(yīng)，如鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫、臭氧脅迫等[12]。因?yàn)橹参锛?xì)胞內(nèi)存在一氧化氮合成酶（NOS）和硝酸還原酶（NR）2條NO產(chǎn)生的酶促途徑，所以用NO合成酶突變體Atnoa1、硝酸還原酶nialnia2突變體作為試驗(yàn)材料，以研究分別阻斷這2種NO合成途徑后對(duì)擬南芥耐鋁能力的影響。先前的藥理學(xué)證據(jù)表明，NO參與了植物對(duì)鋁毒害的耐受性[9]，然而在遺傳學(xué)上的直接證據(jù)還未有報(bào)道。

植物根生長(zhǎng)受到抑制是植物遭受鋁毒害時(shí)一個(gè)最顯著的特征。本研究結(jié)果顯示，鋁毒害明顯地抑制了擬南芥根的生長(zhǎng)（圖1），表明擬南芥植株遭受到了鋁毒害；進(jìn)一步的結(jié)果顯示，nialnia2突變體比野生型擬南芥和Atnoa1突變體對(duì)鋁毒害更敏感（圖1），表明硝酸還原酶途徑產(chǎn)生的NO可能參與了植物對(duì)鋁毒害的耐受性。

有報(bào)道表明，鋁毒害可對(duì)植物造成氧化脅迫，從而導(dǎo)致植物質(zhì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化[13]。植物細(xì)胞中活性氧的過(guò)量累積是對(duì)植物遭受鋁毒害的一種反應(yīng)[3]。為了進(jìn)一步探討NO增強(qiáng)植物對(duì)鋁毒害耐受性的機(jī)制，本研究檢測(cè)了鋁毒害對(duì)野生型擬南芥和nialnia2、Atnoa1突變體中MDA和活性氧含量的影響。研究結(jié)果表明，鋁毒害明顯地增加了擬南芥植株中MDA和活性氧的含量，而且nialnia2突變體植株中增加的幅度最大（圖2、圖3、圖4），這些結(jié)果表明硝酸還原酶依賴(lài)的NO可能通過(guò)減輕植物遭受氧化脅迫程度從而增強(qiáng)植物對(duì)鋁毒害的耐受性。為了進(jìn)一步查明NO緩解植物鋁誘導(dǎo)的氧化脅迫機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了鋁脅迫對(duì)野生型和突變體中AsA和GSH含量的影響。結(jié)果顯示，鋁增強(qiáng)了植株中AsA和GSH的含量，但是nialnia2突變體植株中增加的幅度最?。▓D5、圖6）。這些結(jié)果表明，NO緩解鋁誘導(dǎo)的氧化傷害是通過(guò)調(diào)節(jié)AsA和GSH含量來(lái)清除過(guò)量活性氧而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)NO參與了植物對(duì)鋁毒害的耐受性，而且硝酸還原酶途徑產(chǎn)生的NO參與了這一過(guò)程，NO通過(guò)調(diào)節(jié)AsA和GSH含量來(lái)清除過(guò)量活性氧，從而維持細(xì)胞內(nèi)一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的氧化還原平衡狀態(tài)，避免細(xì)胞遭受?chē)?yán)重的氧化傷害，以此來(lái)適應(yīng)鋁脅迫環(huán)境。然而，對(duì)于NO增強(qiáng)植物對(duì)鋁毒害耐受性的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步更深入地研究。

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