張跡++李智++張宇++袁巧云

摘要：大腸桿菌BL21（DE3）菌株是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)最常用的宿主菌株，因此人們需要1種便捷有效的感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化方法。一步法感受態(tài)細(xì)胞制備操作方便，只加1種試劑即可，更快捷穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化也更方便，不需要熱激。研究大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞一步法制備對(duì)BL21菌株的適用性，并對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行探索和優(yōu)化。結(jié)果表明，該一步法制備的BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞可獲得106 CFU/μg DNA轉(zhuǎn)化效率，完全能夠滿足常規(guī)轉(zhuǎn)化要求。轉(zhuǎn)化過(guò)程中相關(guān)參數(shù)的最佳條件為冰水浴30 min，室溫放置10 min，37 ℃、150 r/min振蕩復(fù)蘇40 min。

關(guān)鍵詞：感受態(tài)細(xì)胞制備；一步法；大腸桿菌BL21（DE3）菌株；轉(zhuǎn)化條件

中圖分類號(hào)： X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0529-03

收稿日期：2015-11-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號(hào)：31300099）；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201310323046X）。

作者簡(jiǎn)介：張跡（1982—），男，江蘇宿遷人，博士，講師，主要從事環(huán)境污染物微生物降解及污染環(huán)境微生物修復(fù)研究。E-mail：zhangjihnu@163.com。

在分子生物學(xué)試驗(yàn)中，DNA重組技術(shù)和外源基因的表達(dá)是最常用的研究手段之一，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞是其頻繁使用的一項(xiàng)基本操作技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)分為2個(gè)部分，即大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化。目前，制備感受態(tài)細(xì)胞最常用的方法是CaCl2法[1-2]和電穿孔法[3]。電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率高，但是需要一套特殊儀器，操作過(guò)程也很繁瑣；CaCl2法不需要特殊儀器，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，但耗時(shí)較長(zhǎng)[4]。1989年Chung等報(bào)道了一步法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，該法操作簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好，獲得單位質(zhì)量轉(zhuǎn)化效率達(dá)到107～108個(gè)/μg單位質(zhì)量的轉(zhuǎn)化子，能夠滿足常規(guī)試驗(yàn)要求，并可在-70 ℃下長(zhǎng)期保存。一步法感受態(tài)細(xì)胞制備及其轉(zhuǎn)化法適用于DH5α、HB101、JM109等多個(gè)大腸桿菌常用菌株[5]。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[6]，而大腸桿菌BL21（DE3）菌株是該表達(dá)系統(tǒng)最常用的宿主菌株[7]，需要便捷有效的感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化方法。本研究采用一步法制備大腸桿菌BL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞，研究該方法對(duì)BL21菌株的適用性，并對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行探索和優(yōu)化。

1材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

供試菌株：大腸桿菌BL21（DE3）菌株，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

供試質(zhì)粒：PUC19（2 686 bp）、pET29a（5 371 bp）、pET29a-gfp（5 948 bp）。

1.2試劑

質(zhì)粒抽提試劑盒，購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；IPTG、X-GaL、PEG3350、相關(guān)抗生素，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3主要培養(yǎng)基和溶液配方

LB培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨（Tryptone，OXCID）10.0 g；酵母提取物（Yeast extract，OXCID）5.0 g；NaCl 5.0 g；用去離子水補(bǔ)足1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入2%瓊脂。

轉(zhuǎn)化與貯存溶液（TSS）：液體LB培養(yǎng)基調(diào)pH值為6.5，含10% PEG3350，5%二甲基亞砜（DMSO），10%甘油，MgCl2 10 mmol/L，MgSO4 10 mmol/L，高壓蒸汽滅菌。

5×KCM溶液：KCl 0.5 mol/L，CaCl2 0.15 mol/L，MgCl2 0.25 mol/L。該溶液僅需少量配制（以mL計(jì)），過(guò)濾除菌，分裝成小份于-20 ℃保存?zhèn)溆茫煞磸?fù)凍融。

1.4大腸桿菌BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞的制備

制備方法參照文獻(xiàn)[5]所介紹的一步法。活化大腸桿菌BL21菌株，從37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜的新鮮LB平板中挑取BL21單菌落，接種到3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液接種入100 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm=0.3～0.5（約3 h）；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到滅菌的50 mL離心管中，置冰上10 min；4 ℃、6 000 r/min離心5 min，棄上清；用10 mL預(yù)冷的無(wú)菌TSS重懸菌體細(xì)胞；冰上放置10 min，分裝120 μL/管（在冰上操作），-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5大腸桿菌一步法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

取無(wú)菌的1.5 mL離心管，加入1 μL待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，5×KCM 10 μL，ddH2O 39 μL，置冰上；從-70 ℃冰箱中取出大腸桿菌BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞，立即融化；吸取50 μL感受態(tài)細(xì)胞加入上述離心管中，輕輕吹吸使之與上述試劑混勻，冰水浴20 min，室溫放置10 min；加入500 μL新鮮液體LB培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min搖床中，振蕩復(fù)蘇40～50 min；室溫、 6 000 r/min 離心3 min，棄部分上清，留取約200 μL，重懸后涂布抗生素平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察平板，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù)，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率=感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后形成的菌落數(shù)（CFU）/DNA質(zhì)量（ecg）。

轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒均采用質(zhì)粒提取試劑盒并按其說(shuō)明書要求步驟操作，提取的質(zhì)粒樣品經(jīng)適度稀釋后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)其條帶亮度與標(biāo)準(zhǔn)的marker條帶比較并估算質(zhì)粒濃度。

1.6轉(zhuǎn)化過(guò)程中的參數(shù)處理

在大腸桿菌BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中，分別設(shè)置冰水浴時(shí)間（0、5、10、20、30、40、50 min）、室溫放置時(shí)間（0、5、10、20、30、40、50 min）、復(fù)蘇過(guò)程中的搖床轉(zhuǎn)速（0、50、100、150、180、200 r/min）及復(fù)蘇時(shí)間（0、5、10、20、30、40、50 min）等一系列不同的參數(shù)，研究這些參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，探索大腸桿菌BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。此外，為研究感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后于4 ℃放置對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，將感受態(tài)細(xì)胞在最佳條件下轉(zhuǎn)化并復(fù)蘇后，涂布抗生素平板，并于4 ℃保存，定時(shí)取平板（0、2、12、24 h），37 ℃ 過(guò)夜培養(yǎng)后分析計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。以上所有處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值，用Excel作圖，圖中的誤差線均表示標(biāo)準(zhǔn)差。

2結(jié)果與分析

2.1不同質(zhì)粒對(duì)BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

本研究分別使用大小不同的PUC19、pET29a、pET29a-gfp質(zhì)粒對(duì)BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，以探討大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞一步制備法對(duì)BL21菌株的適用性。轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，3種不同大小的質(zhì)粒均對(duì)大腸桿菌BL21菌株一步法制備的感受態(tài)細(xì)胞成功地實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化；其中分子量較小的質(zhì)粒pUC19所獲得的轉(zhuǎn)化效率最高，超過(guò)5×106 CFU/μg，分子量較大的質(zhì)粒pET29a和pET29a-gfp獲得的轉(zhuǎn)化效率約為3×106 CFU/μg，略低于pUC19（圖1）。

pET系列載體是常用的大腸桿菌表達(dá)載體，含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子，廣泛應(yīng)用于在大腸桿菌BL21菌株中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白[8-9]。結(jié)果表明，pET29a和pET29a-gfp成功地轉(zhuǎn)化入BL21菌株的一步法感受態(tài)細(xì)胞，并在本研究的試驗(yàn)條件下能獲得約 106 CFU/μg 的轉(zhuǎn)化效率，表明一步法制備的大腸桿菌BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞完全能夠滿足常規(guī)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的要求。

2.2冰水浴時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

在對(duì)大腸桿菌BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，設(shè)置不同的冰水浴時(shí)間。圖2表明，前30 min隨著冰水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率越來(lái)越高，在冰水浴30 min時(shí)表現(xiàn)出最高轉(zhuǎn)化效率，達(dá)到5.4×106 CFU/μg，之后轉(zhuǎn)化效率有所下降。因此，將轉(zhuǎn)化過(guò)程中的冰水浴時(shí)間設(shè)置為30 min最好。

2.3室溫放置時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

大腸桿菌一步法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中，在冰水浴結(jié)束后將轉(zhuǎn)化體系直接放置在室溫中以替代傳統(tǒng)CaCl2法的熱休克步驟。為研究室溫放置時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，本研究設(shè)置一系列不同的室溫放置時(shí)間。圖3顯示：本組試驗(yàn)中室溫放置10 min時(shí)，獲得最高的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到7.5×106 CFU/μg；室溫放置時(shí)間不足10 min時(shí)，轉(zhuǎn)化效率隨室溫放置時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸提高；放置時(shí)間超過(guò)10 min時(shí)，轉(zhuǎn)化效率則逐漸降低。因此，在室溫中放置10 min是大腸桿菌BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中該參數(shù)的最適條件。

2.4復(fù)蘇時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

復(fù)蘇是大腸桿菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要步驟，大腸桿菌在此過(guò)程中將修復(fù)感受態(tài)細(xì)胞制備時(shí)留下的損傷，用于轉(zhuǎn)化子篩選的抗生素抗性基因在此過(guò)程中也得到了初步表達(dá)。為了研究一步法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的適宜復(fù)蘇時(shí)間，本研究按照 10 min 的時(shí)間間隔設(shè)置了6個(gè)復(fù)蘇時(shí)間。圖4表明：隨著復(fù)蘇時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率逐步提高，至復(fù)蘇40 min時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高值；復(fù)蘇時(shí)間為50 min時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較復(fù)蘇30、40 min 時(shí)有所降低。因此，40 min是大腸桿菌BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最適復(fù)蘇時(shí)間。

2.5復(fù)蘇轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

復(fù)蘇過(guò)程中搖床振蕩的轉(zhuǎn)速對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)化的效率有明顯影響。為研究大腸桿菌BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中最適的轉(zhuǎn)速，本試驗(yàn)設(shè)置了6組不同的復(fù)蘇轉(zhuǎn)速，圖5顯示：復(fù)蘇轉(zhuǎn)速在0～150 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，轉(zhuǎn)化的效率逐漸增高；轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到 4.5×106 CFU/μg；復(fù)蘇轉(zhuǎn)速超過(guò)150 r/min之后，轉(zhuǎn)化效率開(kāi)始逐漸下降。因此，150 r/min是大腸桿菌BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最適復(fù)蘇轉(zhuǎn)速。

在研究復(fù)蘇轉(zhuǎn)速對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響的試驗(yàn)過(guò)程中，由于使用同一臺(tái)搖床設(shè)置不同轉(zhuǎn)速，因此本試驗(yàn)不同處理的轉(zhuǎn)化過(guò)程就存在先后。為保證所有的處理組同時(shí)培養(yǎng)，將先轉(zhuǎn)化的菌體細(xì)胞涂布抗生素平板后于4 ℃冰箱中放置，待本試驗(yàn)所有處理全部轉(zhuǎn)化結(jié)束后一同放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然而，在本試驗(yàn)過(guò)程中偶然發(fā)現(xiàn)相同的重復(fù)平板在4 ℃放置后轉(zhuǎn)化子數(shù)明顯比未在冰箱中放置過(guò)的多，所以重新做了復(fù)蘇轉(zhuǎn)速的試驗(yàn)，以避免4 ℃冰箱中放置對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，同時(shí)又對(duì) 4 ℃ 冰箱中放置時(shí)間對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響進(jìn)行研究。

2.64 ℃冰箱中放置時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

之前的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化后涂布的抗生素篩選平板在放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)之前，于4 ℃冰箱中放置一段時(shí)間對(duì)最終的轉(zhuǎn)化效率會(huì)產(chǎn)生一定的影響。圖6表明：抗生素篩選平板在4 ℃冰箱中放置一段時(shí)間，長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子數(shù)明顯比未在冰箱中放置過(guò)的多，冰箱中放置2 h轉(zhuǎn)化效率最高，在冰箱中放置12、24 h的轉(zhuǎn)化效率明顯下降，但仍比未在冰箱中放置過(guò)的高。

3討論

目前，生命科學(xué)研究領(lǐng)域的分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)高度發(fā)展[CM（25]，并被廣泛應(yīng)用。感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化是其中的一項(xiàng)基本操作，其主要方法有化學(xué)轉(zhuǎn)化法[1-2]和電轉(zhuǎn)化法[3]。最常用的化學(xué)法是CaCl2法，此外，大腸桿菌感受態(tài)化學(xué)制備方法還有甘油-聚乙二醇法[10-11]、氯化銣法[12]和一步制備法[5，13]。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備一步法操作便捷，其轉(zhuǎn)化也較方便，適用于DH5α、HB101、JM109等多個(gè)大腸桿菌常用菌株。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率除了與其制備方法和菌株有關(guān)外，還與其凍存條件以及轉(zhuǎn)化過(guò)程密切相關(guān)[14-16]。

本研究采用一步法制備的大腸桿菌BL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞可獲得106～107 CFU/μg的轉(zhuǎn)化效率，完全能夠滿足常規(guī)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的要求。同時(shí)該結(jié)果也表明，一步法可用于大腸桿菌BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞制備。為探討和優(yōu)化BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)條件，本研究在參照傳統(tǒng)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化步驟的基礎(chǔ)上分別設(shè)置冰水浴時(shí)間、室溫放置時(shí)間、復(fù)蘇過(guò)程中的搖床轉(zhuǎn)速以及復(fù)蘇時(shí)間等一系列不同的參數(shù)。

轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌BL21菌株一步法感受態(tài)細(xì)胞的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件：轉(zhuǎn)化體系先冰水浴30 min，然后取出樣品置于室溫中放置10 min，加入適量新鮮LB培養(yǎng)基后置于37 ℃、150 r/min搖床中振蕩復(fù)蘇40 min，涂布抗生素平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子。

在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體系涂布抗生素平板后置于4 ℃冰箱中放置一段時(shí)間，長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子數(shù)明顯比未在 4 ℃ 冰箱中放置過(guò)而直接于37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)的多，且重復(fù)幾次試驗(yàn)均得到類似結(jié)果。為此，筆者做了一組轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，并設(shè)置了一系列不同的4 ℃冰箱放置時(shí)間。結(jié)果顯示，在4 ℃冰箱中放置2 h轉(zhuǎn)化效率最高，在冰箱中放置12、24 h的轉(zhuǎn)化效率又有所下降，但仍比未在冰箱中放置過(guò)的高。筆者目前對(duì)于出現(xiàn)這一試驗(yàn)結(jié)果的原因尚未十分明了，還需要進(jìn)一步研究和分析。

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