舒翠霞 ，龔 丹，張蕾萍 ，趙嘉祥

（1.蘇州市公安局，江蘇 蘇州 215131；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

佐匹克隆又名憶夢返，為環(huán)吡咯酮類催眠藥，1987年在法國首次上市，1990年進入我國市場。隨著這種藥物在臨床上的廣泛應用，利用佐匹克隆實施麻醉搶劫、迷奸、兇殺等案件時有報道[1-3]，也有誤服或口服佐匹克隆自殺的事件發(fā)生[4-6]。因此，快速、準確測定生物樣品中佐匹克隆成分在偵查辦案過程中對確定案（事）件性質、分析作案手段、提供訴訟證據(jù)等方面具有不可替代的作用。目前，佐匹克隆的檢測方法有紫外分光光度（UV）法[7]、熒光分光光度法[8-9]、氣相色譜（GC）法[10-13]、氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）法[14-16]、高效液相色譜（HPLC）法[17-19]和液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）法[6，20-24]等，本文在全面介紹不同生物樣品中佐匹克隆提取凈化方法的基礎上，重點介紹已廣泛應用的檢測分析方法。

1 生物檢材

血液和尿液是最常見的生物檢材，目前關于佐匹克隆的研究報道主要集中于血清、血漿、全血和尿液中佐匹克隆檢測分析，也有少數(shù)關于肝組織、腦組織等生物檢材中佐匹克隆的檢測分析報道。尿液檢測時限比血液、血漿檢測時限長，對于治療劑量的佐匹克隆，血液的檢測窗口時長為6～20 h，尿液約為24～48h[25-26]，雖然現(xiàn)在還缺乏更確切的數(shù)據(jù)，但此窗口可能會隨著藥物的攝取量和中毒情況而增加。在藥物犯罪中，可能會使用高劑量藥物，血液中佐匹克隆檢測的最大時間窗可達到48h，尿液為72h[27]。

一些超過血液和尿液最大檢測時限的案件中，毛發(fā)、指甲可作為一種重要的補充樣品進行目標物檢測分析[1]。由于毛發(fā)、指甲取樣量少，因此有關毛發(fā)、指甲中目標物檢測一般采用靈敏度高的液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）法[25-28]。毛發(fā)樣品一般在案發(fā)后1個月采集[1]。有文獻[29]報道，唾液可反映近期攝藥史，但其存在取樣量不足，易受食品、飲料等干擾以及含藥量低等不足之處[30]。

2 提取方法

國內外關于生物樣品中佐匹克隆提取方法的報道，主要集中于液液萃取[17，21，31]、固相萃取[10，14，20，22]和沉淀蛋白-直接提取法[6，14]。沉淀蛋白法一般采用乙腈作為蛋白沉淀劑，直接提取后供高效液相色譜或高效液相色譜-質譜聯(lián)用檢測，該方法主要適用于血、肝等生物樣品的處理。而液液提取法則適用于多數(shù)生物樣品，直接采用乙醚、乙酸乙酯或正丁基氯進行提取，回收率分別在78.6%、78.9%和73.4%以上，也有將生物樣品先堿化后再用有機溶劑提取的報道[11，19，23]。ELIASSEN等[23]向100 μL血樣中添加pH=11的硼酸鹽緩沖液75μL，再用 1.2mL 的 V（乙酸乙酯）∶V（正庚烷）=80∶20提取，低、中、高濃度的回收率均大于70%。STANKE等[11]向1 mL血樣中添加pH=9.2的碳酸鹽緩沖液2mL，再用 4mL V（己烷）∶V（二氯甲烷）=4∶3 提取，回收率大于82.5%。

毛發(fā)樣品先用二氯甲烷清洗2次，分成2cm的片段，每個片段分別剪成小于1mm的碎末，浸泡于pH=8.4的磷酸緩沖液中，最后用V（二氯甲烷）∶V（乙醚）=80∶20進行液液萃取，提取回收率可達91.9%[3]。

佐匹克隆的固相萃取研究中多數(shù)采用親水親脂的 HLB 固 相 萃 取 柱[10，14，20，22]，MISTRI 等[22]用 0.05%甲酸稀釋血液后過柱，低、中、高濃度的回收率均大于90.8%。有報道[10]用pH=7.4的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋血液，低、中、高濃度的回收率均大于88.7%。有報道[20]酸性條件下佐匹克隆經(jīng)HLB柱固相萃取回收率明顯好于堿性條件，隨著pH值增大，回收率逐漸下降，在pH=5時回收率達最大值。TONON等[32]采用C18固相萃取腦組織中的佐匹克隆，該處理方法先將腦組織與pH=6的磷酸鈉緩沖液混合后勻漿，稀釋后離心，取上清液上樣，方法的回收率可達91.7%。郭璟琦等[20]認為，固相萃取比液液萃取對血液樣品的提取效果更好，回收率高，雜質干擾少，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。

近年來，有人研發(fā)了分散液液微萃取提取液體察氏培養(yǎng)基中的佐匹克隆及其代謝物[33]，該研究用pH=9.5的鹽酸-Tris緩沖液調節(jié)培養(yǎng)基的pH值，三氯甲烷（100 μL）作為萃取劑，甲醇（300 μL）為分散劑，佐匹克隆的回收率可達82%。該方法較傳統(tǒng)的萃取方法快速、簡單，溶劑消耗少，回收率好。

3 檢測方法

3.1 氣相色譜法和氣相色譜-質譜聯(lián)用法

佐匹克隆的檢測常用氣相色譜結合微量池電子捕獲檢測器（GC-μECD）[12]或氮磷檢測器[10-11]，由于GC-μECD對被測物具有極強的選擇性，佐匹克隆分子中含有強電負性基團Cl-，因此采用GC-μECD檢測具有極高的靈敏度，最低檢出限為0.02μg/mL。同樣由于氯原子的存在，佐匹克隆不僅適用氣質聯(lián)用電子轟擊源分析，也適用于氣質聯(lián)用負化學源分析。有報道[14]對這兩種檢測器進行比較，結果顯示，佐匹克隆在電子轟擊源上的檢出限是0.2 μg/mL，而負化學源上的檢出限是0.03μg/mL，在減少色譜圖中雜質干擾方面負化學源也占有較大優(yōu)勢。

氣相色譜和氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定佐匹克隆，一般均采用毛細管柱和程序升溫法，如采用毛細管柱200℃保持1min，以20℃/min升至280℃（保持15min），或 240℃保持 1min，以 10℃/min升溫至 290℃（保持20min）。佐匹克隆的降解溫度為普通氣相色譜程序升溫法中的臨界溫度[34]，所以不能用普通氣相色譜程序升溫法或普通氣相色譜程序升溫法的氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定。

3.2 高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯(lián)用法

高效液相色譜法測定生物樣品中佐匹克隆多采用等度洗脫法。一般情況下，樣品中的佐匹克隆與雜質都能得到較好的分離[17，19，35-36]。高效液相色譜柱常采用反相 C18填料[17，19，35]，流動相體系有 20mmol/L V（乙酸鈉緩沖液，pH=6.0）∶V（乙腈）∶V（甲醇）=67∶24∶9[17]、V（乙腈）∶V（水）∶V（0.5mol/L 磷酸二氫鈉）=25∶72∶3[19]、V（0.02mol/L 磷酸二氫鉀）∶V（甲醇）=38∶62[35]、V（磷酸二氫鈉）∶V（甲醇）=45∶55[37]等，流動相的 pH 值常采用磷酸鹽調節(jié)。由于生物樣品成分復雜、雜質多，對檢測器的要求比較高，而佐匹克隆分子結構中有非常強的熒光發(fā)射基團吡咯連吡嗪環(huán)，使得熒光檢測的靈敏度比紫外線高，為了保證足夠的靈敏度，通常采用熒光檢測器[17，19，35-36]，激發(fā)波長 315nm，發(fā)射波長 380nm或 385 nm[19，35]，也有激發(fā)波長選擇 307 nm，發(fā)射波長483 nm[17]。EI-SHAHENY等[36]使用熒光程序檢測佐匹克隆及其代謝物，0～5.6min內激發(fā)波長305nm，發(fā)射波長370nm，5.6min后激發(fā)波長320nm，發(fā)射波長480nm。

近年來液相色譜-質譜聯(lián)用法檢測生物樣品中的佐匹克隆報道增多[6，20-24]，該方法具有高靈敏度、高特異性的特點，最低檢出限可達0.08ng/mL[23]，可同時檢測生物樣品中多種物質[21，23，38]，如佐匹克隆及其代謝物[6，22，24]，國內關于佐匹克隆代謝物的檢測報道較少[6]。液相色譜-質譜聯(lián)用法中，色譜柱常采用反相C18填料[20-21，23-24]，由于同時檢測多種物質，多數(shù)采用梯度洗脫法[6，15，21]，流動相有甲酸銨（含 0.1%甲酸）-乙腈[21]、0.1%甲酸水和乙腈[6]、甲醇和0.2%甲酸（含5 mmol/L甲酸銨）水溶液[20]，pH=5.0醋酸銨緩沖液和0.05%的醋酸甲醇溶液[23]等，這些流動相中多數(shù)用甲酸調節(jié)pH值。TONON等[32]使用CHIRALPAK AD手性色譜柱分析腦組織中的佐匹克隆，最低定量限可達0.29ng/g，分析總時長小于5min。

3.3 其他方法

近年來還有人采用紫外分光光度法檢測血液中佐匹克隆[7]，該方法先用鹽酸酸化血清，目的是增加佐匹克隆在血清中的溶解度，再加10%的高氯酸甲醇溶液沉淀蛋白，血清中佐匹克隆在（310±1）nm處有最大吸收峰，比佐匹克隆標準品最大吸收峰（303±1）nm波長略有“紅移”，可能是佐匹克隆可變異的助色基團溶解在10%高氯酸甲醇溶液中使吸收光譜的位置發(fā)生了變化，該方法在3.0～30.0 g/mL范圍內線性關系良好，最低檢出限為2.0g/mL。

早些年還有采用熒光分光光度法測定血中佐匹克隆的報道[8-9]，在血清樣品中添加pH=6.86的磷酸鹽緩沖液后再用 V（二氯甲烷）∶V（異戊醇）=98∶2 液液萃取，激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長520 nm，最低檢出限0.03mg/L，熒光分光光度法測定佐匹克隆線性范圍很寬，不同數(shù)量級的藥物濃度其標準曲線斜率不同，當藥物濃度超過500mg/L時產生熒光自熄滅現(xiàn)象。

此外，還有采用毛細管電泳-二極管陣列檢測法測定佐匹克隆及其代謝物[33]和單掃描示波極譜法測定佐匹克隆[39]的報道。毛細管電泳法使用新毛細管時先用1mol/L氫氧化鈉和去離子水先后各沖洗30min，每天使用前需用0.1mol/L氫氧化鈉和去離子水各沖洗10min，活化好的毛細管進樣前用0.1mol/L氫氧化鈉和去離子水各沖洗1min。該分析中選用磷酸鈉作為緩沖溶液，pH=2.5、濃度為50mol/L時峰形較好，遷移時間短，且峰面積和遷移時間重現(xiàn)性好。進樣時間選擇在8s，進樣壓力為1psi。單掃描示波極譜法是在0.1mol/L的鹽酸溶液中，微量佐匹克隆可產生一個靈敏度較高的極譜還原波，根據(jù)佐匹克隆在一定濃度范圍內與波峰有良好的線性關系，測定血清中佐匹克隆含量。研究[36]指出，血清中佐匹克隆經(jīng)有機相提取后必須蒸干方能用pH=3的鹽酸溶液溶解測定，否則測定結果偏低。

4 其他問題

需要指出的是，多篇文獻[13，23，40-42]報道佐匹克隆在甲醇、乙醇等親核溶劑中不穩(wěn)定、易分解，因此在檢驗疑似佐匹克隆中毒的案件時，盡可能使用非親核試劑（三氯甲烷、二氯甲烷和乙腈等）作為溶劑，以免發(fā)生分解而漏檢。也有文獻[42]指出佐匹克隆在pH大于9時不穩(wěn)定。NILSSON等[24]研究了全血中佐匹克隆的穩(wěn)定性，結果顯示，血中的佐匹克隆在一定時間和溫度的條件下會分解，在長期儲存的血樣中可能因為佐匹克隆分解而檢測不到，佐匹克隆的最佳儲存條件是-20℃短期儲存，-20℃可以保存5～6個月，5℃可以儲存1個星期，20℃可以保存2d，該研究還指出凍融對血中佐匹克隆沒有影響。因此在推測血中佐匹克隆的真實濃度時應當考慮佐匹克隆的分解。NILSSON等[24]還研究利用佐匹克隆代謝產物2-氨基-5-氯吡啶來估算血中佐匹克隆的原始濃度。

佐匹克隆在人體內，主要通過3種途徑在肝代謝，僅4%～5%以原型從尿中排出：11%經(jīng)側鏈氧化形成活性較弱的佐匹克隆N-氧化物；15%代謝成無活性的N-去甲基佐匹克隆均經(jīng)腎排泄；50%酯鍵水解（包括氧化脫羧）產生無活性的代謝物，其中部分經(jīng)肺以CO2形式排出。另外，佐匹克隆在動物尿液和胃組織中含量高，血液中佐匹克隆含量較低[8，12]。國內報道1例佐匹克隆中毒死亡案例[6]，死者尿液中佐匹克隆及代謝物的含量均高于血液中的濃度，而佐匹克隆N-氧化物和N-去甲基佐匹克隆也可作為佐匹克隆染毒的標記物。綜上，尿液和胃組織是最理想的生物檢材，濃度高于血液，因此，應當在最短的時間內取得當事人的尿液。

5 結 語

綜上所述，采用氣相色譜、氣相色譜-質譜聯(lián)用、高效液相色譜、液相色譜-質譜聯(lián)用、紫外分光光度等方法測定生物樣品中佐匹克隆均具有較高的靈敏度、精密度和準確度。液相色譜-質譜聯(lián)用法除具有高靈敏度、高特異性特點，還能對復雜混合物進行高效分離，定性的同時進行定量分析，是生物樣品中佐匹克隆強有力的分析方法，具有很好的發(fā)展前景。隨著分析技術的不斷發(fā)展，生物檢材中佐匹克隆的檢測能力將不斷增強。

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