劉傳亮，譚雪瑩，史光軍

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院，山東青島266000)

Panx1基因過表達(dá)對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞增殖及遷移的影響

劉傳亮，譚雪瑩，史光軍

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院，山東青島266000)

目的探討Panx1基因過表達(dá)對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞增殖及遷移的影響。方法構(gòu)建Panx1過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒和過表達(dá)空載慢病毒質(zhì)粒，包裝生產(chǎn)慢病毒，分別轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞(過表達(dá)組、對(duì)照組)。用Western blotting法檢測Hep3B細(xì)胞Panx1、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力(OD值)，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力(相對(duì)遷移距離、劃痕愈合率)。結(jié)果過表達(dá)組Panx1、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組高(P均<0.05)，Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組低(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)(0 h除外)OD值較對(duì)照組低(P均<0.05);相對(duì)遷移距離較對(duì)照組低,劃痕愈合率較對(duì)照組高(P均<0.05)。結(jié)論P(yáng)anx1基因過表達(dá)可抑制Hep3B細(xì)胞增殖與遷移。

肝腫瘤；Panx1基因；Hep3B細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

肝癌是癌癥死亡的第三大原因，僅次于肺癌和胃癌[1,2]。該病起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者總體生存率低[3,4]。探討與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素，尋找新的防治靶點(diǎn)，是臨床面臨的重要任務(wù)。Pannexin基因是近年發(fā)現(xiàn)的縫隙連接家族的新成員，主要有Panx1、Panx2、Panx3三種亞型[5]。Panx1的6個(gè)亞基形成1個(gè)六聚體，其主要功能是形成大孔單膜通道，該通道可由電壓、細(xì)胞內(nèi)高鈣、細(xì)胞外高鉀等刺激激活。Panx1通道在細(xì)胞通訊和信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮調(diào)控作用[6,7]。研究表明，Panx1參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、炎癥發(fā)生、腦缺血、癲癇和腫瘤等的發(fā)生發(fā)展[8～10]。2017年1～7月, 本研究構(gòu)建Panx1過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，用其轉(zhuǎn)染人肝癌Hep3B細(xì)胞，觀察Hep3B細(xì)胞增殖、遷移能力的變化，以探討Panx1在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑來源 人肝癌細(xì)胞株Hep3B、人胚腎細(xì)胞293T購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Opti-MEM、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、PBS購自Gibico公司；CCK-8購自日本DoJINDO公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；青鏈雙抗購自美國Hyclone公司；Panx1抗體、GAPDH抗體，HRP二抗購自Sigma公司；Panx1過表達(dá)質(zhì)粒和過表達(dá)空載質(zhì)粒、購自南通思特康生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA中抽試劑盒購自Invitrogen公司；慢病毒pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G包裝質(zhì)粒來源于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 慢病毒包裝及Hep3B穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建 病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，由pCMV-dR8.91、pCMV-VSVG、Panx1-OE/Panx1-OE-control組成。293T細(xì)胞融合度在80%～90%時(shí)，將三種質(zhì)粒聯(lián)合PEI轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染5 h后更換完全培養(yǎng)基，24 h后換液，48 h后收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，72 h后再次收集，5 000 r/min離心15 min，去除細(xì)胞碎片，離心后以0.45 μm濾器過濾，過濾后檢測病毒滴度，分裝于15 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱保存。通過梯度實(shí)驗(yàn)來確定嘌呤霉素對(duì)Hep3B細(xì)胞的最佳致死藥物濃度，將Hep3B細(xì)胞隨機(jī)分為過表達(dá)組與對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染Panx1-OE慢病毒和Panx1-OE-control，加入感染增強(qiáng)劑polybrene(終濃度5 μg/mL)，24 h后換液，48 h后加嘌呤霉素2 μL篩選(濃度10 mg/mL)，隔1 d換1次篩選培養(yǎng)基，篩選1周。慢病毒攜帶的Panx1基因即可獲得穩(wěn)定表達(dá)。

1.3 Hep3B細(xì)胞Panx1、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表達(dá)檢測 采用Western blotting法。Hep3B穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞消化裂解，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白總濃度，根據(jù)Panx1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量配制濃縮膠和分離膠，等膠凝固后，將其放入電泳槽中，加電泳液，取各組蛋白30 μg上樣到10%膠，電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)膜裝置，100 V恒壓條件下電轉(zhuǎn)90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，于TBST配5%的脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，加入TBST稀釋的一抗(anti Panx1 1∶500；anti GAPDH 1∶2 000；anti E-cadherin 1∶1 000；anti Vimentin 1∶1 000)，4 ℃孵育12 h，孵育完TBST洗膜3次，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。配制蛋白顯影液上機(jī)檢測。用Image Pro Plus 軟件分析光密度(OD)值。

1.4 Hep3B細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。取兩組細(xì)胞，分別制成1.5×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL細(xì)胞懸液，鋪六塊板。繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測波長450 nm處OD值，每組去掉最大值和最小值，取平均值。

1.5 Hep3B細(xì)胞遷移能力檢測 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。在六孔板后面用記號(hào)筆每孔標(biāo)記5條橫線，取兩組細(xì)胞鋪六孔板，第2天長滿，用20 μL槍頭剪平，每孔劃3條垂直于后面的橫線。PBS緩慢清洗3次，去除懸浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照，培養(yǎng)24 h后，再次拍照，記錄兩次拍照劃痕的距離。用Image Pro Plus 軟件處理分析。相對(duì)遷移距離=0 h劃痕面積/高度-24 h面積/高度，劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 Panx1基因過表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)的影響 過表達(dá)組Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.28±0.17、0.83±0.22、0.08±0.01；對(duì)照組分別為0.56±0.13、0.26±0.04、0.48±0.16。兩組Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 Panx1基因過表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖能力(OD值)的影響 培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h，過表達(dá)組OD值分別為0.201±0.003、0.235±0.006、0.282±0.005、0.359±0.012、0.479±0.005、0.601±0.013；對(duì)照組分別為0.199±0.002、0.249±0.002、0.337±0.007、0.479±0.009、0.678±0.004、0.890±0.006。兩組各時(shí)間點(diǎn)(0 h除外)OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 Panx1基因過表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞遷移能力的影響 過表達(dá)組相對(duì)遷移距離為0.59±0.09，劃痕愈合率為15.01%±1.69%；對(duì)照組分別為0.98%±0.07%、27.11%±2.21%。兩組相對(duì)遷移距離、劃痕愈合率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

轉(zhuǎn)移是癌癥患者預(yù)后差的主要因素。Panx1已被證實(shí)在多種腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在不同器官和組織，其發(fā)揮的功能不同，如Lai等[11]發(fā)現(xiàn)在Panx1缺陷型大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，過表達(dá)Panx1起到腫瘤抑制作用，但在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中內(nèi)源表達(dá)則加速膠質(zhì)瘤腫瘤聚集體形成。在轉(zhuǎn)移進(jìn)展期間，循環(huán)的癌細(xì)胞會(huì)滯留在末端血管內(nèi)，大部分死于機(jī)械變形，F(xiàn)urlow等[12]研究表明，在高度轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，Panx1可通過增加膜通道的機(jī)械敏感性，使轉(zhuǎn)移性細(xì)胞存活，使用Panx1通道抑制劑顯著降低了乳腺癌轉(zhuǎn)移的效率。這些數(shù)據(jù)表明在微血管系統(tǒng)誘導(dǎo)的生物力學(xué)創(chuàng)傷中Panx1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Li等[13]發(fā)現(xiàn)沉默Panx1可抑制U87MG細(xì)胞的增殖。Schalper等[14]報(bào)道Panx1在膽囊腺癌和膽囊組織中表達(dá)不同，在膽囊腺癌中表達(dá)較低，使用Ki67和Panx1免疫染色，發(fā)現(xiàn)Panx1表達(dá)與膽囊癌增殖呈負(fù)相關(guān)。但Panx1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及遷移的作用目前尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)Panx1在肝癌和肝正常組織表達(dá)有顯著差異，在肝癌中表達(dá)高于癌旁組織。提示Panx1可能發(fā)揮癌基因的作用。

為進(jìn)一步探討Panx1與肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本研究構(gòu)建了Panx1過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒和慢病毒空載質(zhì)粒，慢病毒是以人類免疫缺陷1型病毒為缺陷發(fā)展的基因治療載體，能將外源基因有效的整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久穩(wěn)定的表達(dá)，對(duì)感染細(xì)胞和非感染細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒包裝由慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝載體組成，本研究應(yīng)用慢病毒原理，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，收集病毒液感染Hep3B細(xì)胞，構(gòu)建了Hep3B穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，能長久過表達(dá)Panx1基因。研究證實(shí)，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要步驟，其過程涉及細(xì)胞表型的變化，E-cadherin和Vimentin是關(guān)鍵的標(biāo)志物，Vimentin蛋白與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，E-cadherin蛋白與腫瘤生殖轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。Western blotting檢測蛋白(Panx1,E-cadherin,Vimentin)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Hep3B細(xì)胞中三種蛋白表達(dá)具有顯著差異，相對(duì)于對(duì)照組，過表達(dá)組Panx1蛋白表達(dá)效率高，vimentin蛋白表達(dá)量顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Panx1可能有抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。

為求進(jìn)一步驗(yàn)證其在細(xì)胞遷移中的作用，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，劃痕結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力減弱，說明Panx1基因過表達(dá)后抑制了腫瘤的遷移。CCK-8結(jié)果表明，與對(duì)照組相比， Panx1過表達(dá)明顯抑制了Hep3B細(xì)胞的增殖活力。提示Panx1對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞增殖和遷移均有抑制作用。

綜上，Panx1可能與肝癌細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)，其在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到抑制作用，Panx1有望成為肝癌的治療靶分子。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin , 2011，61(2): 69-90.

[2] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics,2002[J]. CA Cancer J Clin , 2005,55:74-108.

[3] Bralet MP, Régimbeau JM, Pineau P, et al.Hepatocellular carcinoma occurring in nonfibrotic liver: epidemiologic and histopathologic analysis of 80 French cases[J]. Hepatology, 2000，32(2):200-204.

[4] Pascual S, Herrera I, Irurzun J. New advances in hepatocellular carcinoma[J].World J Hepatol, 2016,8(9):421-438.

[5] Panchin Y, Kelmanson I, Matz M, et al.A ubiquitous family of putative gap junction molecules[J]. Curr Biol, 2000,10(13):R473-R474.

[6] Chekeni FB, Elliott MR, Sandilos JK, et al. Pannexin 1 channels mediate'find-me'signal release and membrane permeability during apoptosis[J]. Nature, 2010,467(7317):863-867.

[7] Penuela S, Bhalla R, Nag K, et al. Glycosylation regulates pannexin intermixing and cellular localization[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20(20):4313-4123.

[8] Bond SR, Naus CC. The pannexins: past and present[J]. Front Physiol, 2014,5:58.

[9] Adamson SE, Leitinger N. The role of pannexin1 in the induction and resolution of inflammation[J]. FEBS Lett, 2014,588(8):1416-1422.

[10] Langlois S, Xiang X, Young K. Pannexin 1and pannexin 3 channels regulate skeletal muscle myoblast proliferationand differentiation[J]. J Biol Chem, 2014,289(44):30717-30731.

[11] Lai CP, Bechberger JF, Thompson RJ, et al. Tumor-suppressive effects of pannexin 1 in C6 glioma cells[J]. Cancer Res, 2007, 67(4):1545-1554.

[12] Furlow PW, Zhang S, Soong TD, et al. Mechanosensitive pannexin-1 channels mediate microvascular metastatic cell survival[J]. Nat Cell Biol, 2015,17(7):943-952.

[13] Li W, Yang XB, Shi XH, et al. Pannexin-1 silencing inhibits the proliferation of U87-MG cells[J]. Mol Med Rep, 2015,11(5):3487-3492.

[14] Schalper KA, Carvajal-Hausdorf D, Oyarzo MP. Possible role of hemichannels in cancer[J]. Front Physiol, 2014,5:237.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.011

R735.7

A

1002-266X(2017)33-0035-03

史光軍(E-mail:sgjzp@hotmail.com)

2017-07-07)