毒性中藥蟾酥質(zhì)量研究現(xiàn)狀及關(guān)鍵影響因素分析

李宗云+曲婷+王鵬飛+陳兩綿+王智民+高慧敏

[摘要]蟾酥來源于蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B. melanostictus的干燥分泌物，是我國傳統(tǒng)名貴動(dòng)物藥品種，也是國務(wù)院頒布的需要特殊管理的28種毒麻中藥品種之一。蟾酥富含蟾蜍甾和吲哚生物堿類成分，具有強(qiáng)心、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局麻等多種藥理活性。該文從混偽品鑒別、質(zhì)量控制方法等方面系統(tǒng)歸納了蟾酥質(zhì)量研究現(xiàn)狀，分析了影響質(zhì)量的關(guān)鍵因素（基原品種、產(chǎn)地、初加工、炮制等）及存在問題，為完善蟾酥及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提升質(zhì)量控制水平，確保臨床安全用藥提供參考。

[關(guān)鍵詞] 蟾酥； 蟾蜍甾； 吲哚生物堿； 質(zhì)量控制

[Abstract] Toad venom （Chansu） is prepared from the dried secretion of Bufo bufo gargarizans or B. melanostictus. It is not only one of the famous and expensive traditional Chinese medicines（TCMs） from animal origin， but also one of 28 kinds of toxic TCMs to be required for special management issued by the State Council of the People′s Republic of China. Chansu contains the rich bufadienolides and indole alkaloids， and displays various bioactivity including cardiotonic， anti-tumor， analgesia， and local anesthesia. Based on the published references in the recent years， the advance on the identification of adulterants and quality evaluation as well as the influence factors on the quality of toad venom was summarized to improve the quality standards and promote the level of quality control of toad venom and its preparations.

[Key words] toad venom； bufadienolides； indole alkaloids； quality control

蟾酥是我國傳統(tǒng)名貴動(dòng)物藥品種，也是國務(wù)院頒布的需要特殊管理的28種毒麻中藥品種之一^[1]。2015年版 《中國藥典》收載蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B. melanostictus Schneider耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物，味辛、溫，有毒，歸心經(jīng)，具有解毒、止痛，開竅醒神之功效，用于癰疽疔瘡，咽喉腫痛，中暑神昏，痧脹腹痛吐瀉^[2]。蟾酥的化學(xué)成分主要包括蟾蜍甾、吲哚生物堿、膽甾醇的代謝產(chǎn)物以及氨基酸和少量的腎上腺素等其它類化合物，其中蟾蜍甾和吲哚生物堿是主要活性成分，蟾蜍甾以日蟾毒它靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基為主，吲哚生物堿以5-羥色胺和蟾蜍色胺為主^[3]?，F(xiàn)代研究表明蟾酥具有強(qiáng)心、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局麻等多種藥理活性，特別是其抗腫瘤活性成為近年來國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)^[4]。蟾酥臨床應(yīng)用廣泛，療效確切。《部頒標(biāo)準(zhǔn)》和《中國藥典》88個(gè)成方制劑（329個(gè)批號(hào)）均含有之，最著名的有六神丸、麝香保心丸、牙痛一粒丸、蟾酥注射液等。隨著中藥大品種的技術(shù)升級(jí)和銷售量的增長，對(duì)蟾酥資源的需求量逐年增加，導(dǎo)致藥材價(jià)格攀升，商品蟾酥品種混雜、摻雜、摻假現(xiàn)象普遍存在。鑒于蟾蜍甾的高活性和高毒性，安全窗較窄，若用量把握不當(dāng)，很容易引起中毒反應(yīng)的發(fā)生；同時(shí)，蟾蜍色胺類成分具有致幻活性，與蟾酥的安全使用也密切相關(guān)。因此，嚴(yán)格控制蟾酥藥材及飲片的質(zhì)量尤為重要?；诖?，本文從混偽品鑒別、質(zhì)量控制方法等方面系統(tǒng)歸納了蟾酥質(zhì)量研究現(xiàn)狀，分析了影響質(zhì)量的關(guān)鍵因素（基原品種、產(chǎn)地、初加工、炮制等）及存在問題，為完善蟾酥及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提升質(zhì)量控制水平，確保臨床安全用藥提供參考。

1 質(zhì)量研究現(xiàn)狀

關(guān)于蟾酥的化學(xué)成分研究始于20世紀(jì)30年代^[5]，迄今為止，已從不同來源的蟾酥中分離鑒定了9個(gè)吲哚生物堿和近百個(gè)蟾酥甾類成分^[3]，然而，蟾酥藥材及飲片的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法相對(duì)滯后于化學(xué)研究的成果，仍舊處于逐步完善和提高的進(jìn)程中。傳統(tǒng)的蟾酥藥材真?zhèn)舞b定方法有性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別^[6]，現(xiàn)代分析方法涉及重量法、比色法、分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等^[7-9]，其中高效液相色譜最為常用，液質(zhì)聯(lián)用法的精準(zhǔn)度較高。

1.1 藥材真?zhèn)舞b別 蟾酥價(jià)格的攀升（已達(dá)1萬～2萬元/kg）導(dǎo)致市售商品藥材出現(xiàn)摻偽品和偽制品，如摻雜淀粉、泥沙、蛋白、蟾蜍皮等^[10]。有研究者嘗試將蟾酥粉末制成水裝片進(jìn)行顯微鑒別，采用雙縮脲試驗(yàn)和香草醛試驗(yàn)等理化鑒別方法來區(qū)別正品、摻偽品和偽制品^[11-12]。正品蟾酥和一些常見摻偽品的的外觀性狀和理化鑒別特征，見表1。

分泌物來源的蟾酥經(jīng)歷產(chǎn)地初加工之后，缺乏平常藥材固有的基原動(dòng)（植）物的外觀形態(tài)，傳統(tǒng)鑒定法具有一定的局限性。DNA 分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，為動(dòng)物藥材的傳統(tǒng)鑒別提供了有效的輔助手段?；贑OI 基因條形碼技術(shù)的蟾酥藥材分子鑒定，已經(jīng)被列為2015年度中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)“名貴珍稀動(dòng)物藥及混偽品鑒定技術(shù)及規(guī)范應(yīng)用研究”的資助內(nèi)容，預(yù)期成果期望能夠?qū)崿F(xiàn)蟾酥及其混偽品的標(biāo)準(zhǔn)化鑒定。

1.2 含量測(cè)定方法 蟾蜍甾類化合物是蟾酥的主要活性成分，文獻(xiàn)關(guān)于該類成分的含量測(cè)定方法報(bào)道較多，早期有文獻(xiàn)參考《日本藥局方》第九改正版的重量法測(cè)定蟾酥主要成分甾體類物質(zhì)^[14]。越來越多的研究采用HPLC進(jìn)行定量分析，檢測(cè)指標(biāo)由單一成分轉(zhuǎn)向多指標(biāo)同步測(cè)定，指標(biāo)成分主要涉及脂蟾毒配基、華蟾酥毒基、蟾毒靈以及蟾毒它靈、華蟾毒它靈、日蟾毒它靈等極性較大的配基類化合物。LC-MS-MS法能夠?qū)崿F(xiàn)蟾酥中微量成分的定性、定量同步分析。

王京輝等選用0.5%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（50∶50）（磷酸調(diào)節(jié)pH 為3.25±0.02）為流動(dòng)相，建立了蟾酥藥材中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的HPLC測(cè)定法，6個(gè)地區(qū)9批藥材中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的量分別為3.22%～5.62%和2.80%～7.38%。該研究為2000年版《中國藥典》蟾酥藥材含量測(cè)定方法和指標(biāo)成分限度標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了參考^[15]。王浩天等建立了蟾酥提取物中華蟾酥毒基和蟾毒靈的HPLC測(cè)定法^[16]，劉冬等進(jìn)一步對(duì)蟾酥提取物3種脂溶性成分華蟾酥毒基、脂蟾毒配基和蟾毒靈的供試品溶液制備方法進(jìn)行了優(yōu)化^[17]。陳婷測(cè)定了江蘇境內(nèi)10批次蟾酥中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的量分別為3.988%～5.111%和2.039%～3.385%，兩者含量總和均符合現(xiàn)版藥典不低于6.0%的要求^[18]。董瑋瑋等研究發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上蟾酥樣品中脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的含量差異很大，在14 批蟾酥樣品中只有2 批符合現(xiàn)版藥典規(guī)定，6批樣品為偽制品，不含藥典規(guī)定的指標(biāo)性成分，而另外6批樣品均有不同程度的摻假現(xiàn)象^[19]。

除了上述3個(gè)指標(biāo)成分，蟾毒它靈、沙蟾毒精、日蟾毒它靈等極性相對(duì)較大的蟾蜍甾生物活性的廣泛報(bào)道，使之在質(zhì)量控制中的作用逐步被重視，同步檢測(cè)日蟾毒它靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基中的4^[20]，5^[21-22]，7^[23]，8種^[24]成分的HPLC方法被報(bào)道。然而，隨著檢測(cè)指標(biāo)的增多，每個(gè)待測(cè)色譜峰的純度需要特別關(guān)注，比如筆者在建立蟾毒配基類多成分檢測(cè)方法的過程中，曾考慮除檢測(cè)的5 種成分之外，還同時(shí)測(cè)定沙蟾毒精和華蟾毒它靈的含量，但是經(jīng)過系統(tǒng)的色譜條件優(yōu)化之后，沙蟾毒精和華蟾毒它靈的色譜峰純度檢查提示仍不是單一峰，因此最終只進(jìn)行了5 種成分的同時(shí)定量分析^[21]。基于這種情況，液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行色譜峰的定性鑒別和峰純度的輔助判定顯得十分必要^[24-26]，以驗(yàn)證待測(cè)色譜峰的正確性，避免對(duì)照品不真實(shí)產(chǎn)生的測(cè)定結(jié)果偏差（如文獻(xiàn)[22]中蟾毒靈的色譜峰在沙蟾毒精之前，可能是兩者對(duì)照品存在問題）。

蟾酥中另外一類主成分吲哚生物堿，是內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺及其代謝產(chǎn)物，具有血管收縮，致幻，細(xì)胞毒等活性。同時(shí)，五羥色胺是人體的內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，它介導(dǎo)的五羥色胺信號(hào)系統(tǒng)在抑郁、焦慮、偏頭痛、高血壓、疼痛和嘔吐等各種調(diào)節(jié)過程中起著關(guān)鍵作用。因此，蟾酥中該類物質(zhì)在其品質(zhì)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制研究中的地位逐漸被關(guān)注。張屏等^[27]采用HPLC同時(shí)測(cè)定4種吲哚生物堿和10種蟾毒配基類成分，五羥色胺、N-甲基五羥色胺、蟾蜍色胺、蟾蜍色胺內(nèi)鹽的量分別為1.90%～5.06%，0.35%～0.85%，0.04%～0.63%和1.29%～5.75%。在建立蟾蜍類藥材中5種吲哚生物堿（五羥色胺、N-甲基五羥色胺、N，N-二甲基五羥色胺、N，N，N-三甲基五羥色胺和蟾蜍噻嚀）含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了11批次蟾酥樣品中該類物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)五羥色胺、N-甲基五羥色胺、N，N，N-三甲基五羥色胺均具有較高的含量水平，而蟾蜍噻嚀在蟾酥中含量極低（低于檢測(cè)限），五羥色胺及其氮甲基衍生物的總量為3.31%～17.40%^[21]。也有學(xué)者^[28]建立了商品蟾酥中單一指標(biāo)成分5-羥色胺的HPLC測(cè)定法，10批樣品中均檢測(cè)出5-羥色胺，其量在0.392 6～50.06 mg·g^-1。上述研究均為將蟾毒色胺類成分增補(bǔ)為蟾酥藥材及其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)提供了方法學(xué)參考。

1.3 指紋圖譜研究 在薄層色譜、高效液相色譜分析的基礎(chǔ)上采用不同的統(tǒng)計(jì)處理方法對(duì)蟾酥進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別，在蟾酥質(zhì)量、產(chǎn)地、種屬、真?zhèn)蔚呐袆e中可以克服人工鑒定的主觀因素，更加準(zhǔn)確地判斷蟾酥的真?zhèn)蝺?yōu)劣^[29-31]。采用獨(dú)立的多類模式識(shí)別方法對(duì)62個(gè)不同產(chǎn)地、不同基原的蟾蜍品種的蟾酥藥材的薄層色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果識(shí)別出了花背蟾蜍、黑眶蟾蜍和中華蟾蜍3個(gè)基原的蟾酥，并且區(qū)分了南方和北方產(chǎn)中華蟾蜍^[29]。采用系統(tǒng)聚類方法選取22批次蟾酥樣品HPLC圖譜中的7種特征峰，能把15批次正品和7批次市售品聚為不同的類別^[30]。采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型提取22個(gè)自采蟾酥樣品HPLC圖譜的特征，同樣將北方產(chǎn)中華大蟾蜍蟾酥、南方產(chǎn)中華大蟾蜍蟾酥和花背蟾蜍蟾酥分為3類^[31]。一定程度上這些早期的研究，是蟾酥指紋圖譜分析的雛形。近年來有學(xué)者建立了蟾酥HPLC指紋圖譜分析方法，比較全面地反映了蟾酥藥材的化學(xué)成分以及各特征性有效成分間峰面積的相對(duì)比例，進(jìn)而反映蟾酥藥材的內(nèi)在質(zhì)量，蟾酥藥材判斷真?zhèn)?、評(píng)價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供了依據(jù)^[32-33]。張屏等^[27，34]通過不同基原蟾酥的對(duì)照用指紋圖譜，能夠區(qū)分不同來源的蟾酥，建議將指紋圖譜增補(bǔ)為蟾酥國家標(biāo)準(zhǔn)中鑒定藥材真?zhèn)蔚囊罁?jù)。

1.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀 自1963年版《中國藥典》收載蟾酥以來，后續(xù)各版藥典均有收載。1963年版蟾酥藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀鑒別^[35]；1977年版修訂了性狀描述，增補(bǔ)了理化鑒別^[36]；1985年版修訂了鑒別項(xiàng)，增加了以脂蟾毒配基為對(duì)照的薄層鑒別，增補(bǔ)了檢查和浸出物項(xiàng)，要求總灰分不得過5%，酸不溶性灰分不得過2%，氯仿浸出物不得少于18%^[37]；1990年版刪去氯仿浸出物，增補(bǔ)了含量測(cè)定項(xiàng)，采用脂蟾毒配基為對(duì)照品，分光光度法測(cè)定蟾毒內(nèi)脂的含量，要求含蟾毒內(nèi)脂以脂蟾毒配基（C₂₄H₃₂O₄）計(jì)，不得少于15%^[38]；1995年版修訂了薄層鑒別項(xiàng)，以蟾酥對(duì)照藥材、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基作為共同對(duì)照溶液進(jìn)行薄層檢查^[39]；2000年版修訂含量測(cè)定項(xiàng)，采用HPLC法測(cè)定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，要求含華蟾酥毒基（C₂₆H₃₄O₆）和脂蟾毒配基（C₂₄H₃₂O₄）的總量不少于6.0%^[40]；2010年版在檢查項(xiàng)增補(bǔ)了水分限度，要求不得過13%，至此，我國蟾酥藥材的國家標(biāo)準(zhǔn)逐步完善和提高為包括【性狀】、【鑒別】（理化鑒別和薄層鑒別）、【檢查】（水分、總灰分、酸不溶性灰分）和【含量測(cè)定】等項(xiàng)內(nèi)容^[41]，2015年版《中國藥典》維持現(xiàn)狀。與同期國外法定蟾酥藥材標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，《韓國藥典》采用HPLC法，測(cè)定蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的含量，要求3個(gè)指標(biāo)成分含量總和不低于6.0%；《日本藥典》與《韓國藥典》指標(biāo)相同，但要求3個(gè)指標(biāo)成分含量總和不低于5.8%^[34]；顯然現(xiàn)版《中國藥典》的蟾酥藥材標(biāo)準(zhǔn)要求最高。但也應(yīng)該注意到，隨著商品蟾酥價(jià)格的攀升，摻雜使假現(xiàn)象普遍存在，對(duì)于藥材或飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提出了更高的要求，現(xiàn)版標(biāo)準(zhǔn)的局限性突顯。比如【鑒別】和【含量測(cè)定】僅規(guī)定了華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的TLC 定性鑒別和含量限度，對(duì)蟾毒靈、蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、沙蟾毒精和日蟾毒它靈等其它主要蟾毒配基類成分的含量未作出相應(yīng)限定。有學(xué)者^[42]曾對(duì)《中國藥典》1995年版的紫外分光光度法與2000年版的高效液相色譜法測(cè)定的含量進(jìn)行限度比較時(shí)，2種方法判定的蟾酥樣品合格率存在較大差異，HPLC檢測(cè)的2個(gè)指標(biāo)的限度變相降低了20%以上，不能有效地控制蟾酥的質(zhì)量。再者，蟾毒色胺類成分的總量高達(dá)3.31%～17.40%^[21]，過量的該類成分?jǐn)z入會(huì)擾亂體內(nèi)的五羥色胺信號(hào)系統(tǒng)，當(dāng)前并未有合適的分析測(cè)定方法來監(jiān)控其在藥材中的含量，以達(dá)到更安全用藥的目的。

2 影響質(zhì)量的關(guān)鍵因素分析

蟾酥具有高活性、高毒性的特點(diǎn)，質(zhì)量穩(wěn)定均一的原料藥材或飲片是保證臨床用藥安全、有效的關(guān)鍵。通過梳理蟾酥質(zhì)量分析的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)商品蟾酥質(zhì)量差異較大，分析產(chǎn)生這種差異的原因，針對(duì)性提出解決方案，對(duì)于蟾酥質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化至關(guān)重要。除了不法商販故意摻假的行為，蟾酥因其基原動(dòng)物品種、產(chǎn)地、采集季節(jié)和加工方式不同會(huì)對(duì)其化學(xué)組成產(chǎn)生不同影響，這也是致使商品蟾酥質(zhì)量參差不齊的重要原因。

2.1 基原蟾蜍品種 蟾酥不僅是國務(wù)院頒布的需要特殊管理的28種毒麻中藥品種之一，也是國家重點(diǎn)保護(hù)的（二級(jí)）野生動(dòng)植物藥材品種之一。盡管蟾蜍的人工養(yǎng)殖一直受到行業(yè)關(guān)注，工信部2011年度中藥材生產(chǎn)基地建設(shè)及區(qū)域布局項(xiàng)目中資助了瀕危稀缺藥材蟾酥在安徽省和遼寧省的生產(chǎn)基地建設(shè)，2012年度該項(xiàng)目持續(xù)資助了安徽省的基地建設(shè)，2015年度工業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)資金中藥材提升和保障領(lǐng)域項(xiàng)目資助了上海和黃藥業(yè)有限公司牽頭的中華大蟾蜍、蟾酥規(guī)范化及規(guī)模化生產(chǎn)基地建設(shè)。然而，行業(yè)的普遍共識(shí)是，在蟾蜍養(yǎng)殖過程中，從幼蟾到成蟾階段死亡率高一直是當(dāng)前尚未克服的難題。因此，蟾酥鮮漿的采集仍依賴于野外捕捉蟾蜍進(jìn)行。2015年版《中國藥典》規(guī)定蟾酥來源于蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍B. bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B. melanostictus耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物。蟾蜍科蟾蜍屬動(dòng)物品種眾多，我國有10多種，其中分布最廣的是中華大蟾蜍B. bufo gargarizans，其次是花背蟾蜍B. raddei、黑眶蟾蜍B. melanosticus和華西蟾蜍B. andrewsi。有研究表明不同基原的蟾酥蟾蜍甾類成分差異顯著，中華大蟾蜍以蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基為主，黑眶蟾酥、華西蟾酥和花背蟾酥中均未檢出華蟾酥毒基^[43]；除了未檢出華蟾酥毒基外，黑眶蟾酥中19-羥基蟾毒靈為特有成分，這與之前的研究結(jié)果相符^[44]。張屏等^[34]認(rèn)為南美蟾毒精為花背蟾酥的特征峰，沙蟾毒精為華西蟾酥的特征峰，而最近的研究表明花背蟾酥以日蟾毒它靈和脂蟾毒配基為主。綜合上述研究，發(fā)現(xiàn)黑眶蟾酥、華西蟾酥、花背蟾酥中所含主成分及其比例關(guān)系在不同的研究中結(jié)果不同，這可能與各自采集樣品的代表性有關(guān)。此外，美洲蟾蜍以南美蟾毒精為主，綠蟾蜍游離蟾蜍甾較少，結(jié)合蟾蜍甾較多^[44]。這些成分顯著不同的各基原蟾蜍品種，地理上交叉分布，加上捕捉者對(duì)動(dòng)物品種的認(rèn)識(shí)有限，致使容易出現(xiàn)品種混雜現(xiàn)象，勢(shì)必導(dǎo)致蟾酥藥材質(zhì)量的參差不齊，嚴(yán)重影響其療效甚至引起中毒，從而帶來臨床用藥的安全風(fēng)險(xiǎn)升級(jí)。

2.2 產(chǎn)地 藥材的道地性強(qiáng)化了產(chǎn)地對(duì)藥材品質(zhì)的影響，意味著生產(chǎn)的藥材品質(zhì)佳、療效好。蟾酥主產(chǎn)于河北、山東、江蘇、浙江等地，以山東臨沂和江蘇南通最為著稱，江蘇南通的啟東市還有“蟾酥之鄉(xiāng)”的譽(yù)名。有報(bào)道江蘇省內(nèi)10批次樣品華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量之和均大于6.0%^[18]；在江蘇和安徽樣品比較中，蟾蜍它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基含量相對(duì)穩(wěn)定，脂蟾毒配基含量則波動(dòng)較大，但所有批次均符合藥典要求^[15，20]。在全國范圍內(nèi)商品蟾酥比較時(shí)，有研究表明分析樣品100%符合藥典要求^{[23，45]}，有報(bào)告近50%的合格率^[21]，也有研究顯示僅有少數(shù)樣品合格^{[19，46]}?？傮w而言，以山東、江蘇、安徽樣品質(zhì)量較好，河南和四川樣品含量較低；但在鮮漿比較時(shí)，在不考慮加工過程對(duì)成分影響的前提下，只有山東、遼寧和安徽產(chǎn)的蟾酥符合《中國藥典》的規(guī)定^[47]。代表性文獻(xiàn)數(shù)據(jù)展示見圖1。

2.3 采集和初加工 不同的產(chǎn)地氣候各異，鮮漿的采集時(shí)間不同。長江以南，蟾蜍每年4月開始繁殖，5～9月采漿，其中7～8月是高峰期。華東地區(qū)采漿4月開始，延遲到9月結(jié)束^[47]。《中國藥典》記載多于夏、秋季節(jié)捉蟾、采漿，有學(xué)者分析表明秋季采集的中華大蟾蜍耳后腺分泌物中蟾毒配基類成分含量比春季的較高，而且秋季采漿可以避免春季蟾蜍產(chǎn)卵繁殖期，以使資源可持續(xù)發(fā)展^[49]。

合理的采漿方法能夠保證鮮漿外觀品質(zhì)，通常有擠漿法和刮漿法2種，產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)農(nóng)戶多采用擠漿法。在采漿前，將蟾蜍體表洗凈，左手抓蟾，右手持銅制夾鉗，適度用力夾擠，擠盡腺體內(nèi)的漿液。為了提高漿液的采集量和質(zhì)量，有必要建立鮮漿采集的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，以實(shí)現(xiàn)純凈鮮漿采集過程的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化。

對(duì)采集后的鮮漿進(jìn)行初加工處理，是影響蟾酥質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。蟾酥傳統(tǒng)的加工方式一般將過篩除雜后的鮮漿鋪在玻璃板、瓷盤或模具中，烘房烘干，溫度控制在60 ～80 ℃^[50]。根據(jù)干燥介質(zhì)形狀的不同，蟾酥成品主要有團(tuán)酥、棋子酥和片酥等不同形式。山東產(chǎn)區(qū)主要團(tuán)酥、棋子酥，也稱東酥，江蘇以加工片酥為主。不同形狀的蟾酥由于厚度、大小不同，所需干燥時(shí)間不同，可能在此過程中主要成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律不同。前期考察了不同干燥方式對(duì)蟾酥質(zhì)量的影響，從蟾毒配基類和吲哚類生物堿這兩類成分的總含量和樣品外觀色澤考慮，冷凍干燥是最優(yōu)的干燥方式，但是綜合考慮加工的相關(guān)因素（時(shí)間、成本和操作便利性等），60 ～80 ℃烘干是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的選擇，并且與傳統(tǒng)加工方法相符^[51]。最近有學(xué)者以水分、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量考察了片酥加工過程中，室內(nèi)陰干、室內(nèi)晾曬、室外曬干、恒溫45 ℃和恒溫80 ℃等干燥方式的干燥效果，綜合成分含量、干燥效率和成本及操作難易度等因素，建議采用室內(nèi)避光陰干法^[52]。而日本學(xué)者^[53-54]對(duì)干燥溫度、干燥時(shí)間以及干燥介質(zhì)（銅、玻璃、丙烯酸樹脂、鋁和不銹鋼）對(duì)蟾酥中蟾毒配基類成分的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)105 ℃下干燥效果好，且在黃銅上干燥質(zhì)量最佳。通過對(duì)鮮漿在不同溫度放置時(shí)蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基隨放置時(shí)間延長的變化規(guī)律研究，指導(dǎo)鮮漿加工成蟾酥前應(yīng)先在常溫下放置>24 h，再進(jìn)行干燥加工處理^[55]。此外，有學(xué)者采用液質(zhì)聯(lián)用法比較鮮蟾酥和干蟾酥化學(xué)成分的差異，發(fā)現(xiàn)鮮蟾酥與干蟾酥所含化合物在種類及含量上均存在區(qū)別，與干蟾酥相比，鮮蟾酥在蟾毒配基類成分上的含量低、種類少。推測(cè)經(jīng)過加工特別是經(jīng)過常溫放置后再加工的蟾酥，結(jié)合型蟾蜍甾減少，游離型蟾蜍甾種類和含量增加^[56-57]。2項(xiàng)研究結(jié)論相似，有一定的合理性，但仍需要進(jìn)一步商榷，原因在于實(shí)驗(yàn)材料鮮蟾酥和干蟾酥不具有可比性。文獻(xiàn)[56]所用鮮蟾酥來自北京房山蟾蜍，鑒定為黑眶蟾蜍，現(xiàn)采集鮮漿，而干蟾酥為購買自中國食品藥品鑒定研究院的對(duì)照藥材，可能為中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍，也可能是兩者的混合品。文獻(xiàn)[57]鮮蟾酥采自江蘇省南京市抓捕中華大蟾蜍耳后腺分泌物，干蟾酥為購自山東省臨沂藥業(yè)有限公司的商品蟾酥。這也提示，在開展鮮漿加工過程成分動(dòng)態(tài)規(guī)律研究時(shí)，測(cè)試樣本是同批次鮮漿及其干燥品，研究結(jié)論才更具有說服力。

綜上，不同產(chǎn)區(qū)的鮮蟾酥的采集、加工、干燥和貯藏環(huán)節(jié)尚沒有嚴(yán)格的操作規(guī)程，這都會(huì)影響到成品蟾酥的質(zhì)量。生產(chǎn)過程關(guān)鍵環(huán)節(jié)有效成分動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)移規(guī)律的研究也存在結(jié)論不一的現(xiàn)象。因此，有必要在明確成分轉(zhuǎn)移規(guī)律的基礎(chǔ)上，建立采收、初加工、貯藏等生產(chǎn)過程關(guān)鍵環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以保證蟾酥品質(zhì)的相對(duì)穩(wěn)定。

2.4 炮制方法 蟾酥有毒，臨床入藥多經(jīng)炮制。傳統(tǒng)的炮制方法有焙法、酒制、乳汁制和醋制等，現(xiàn)在的炮制方法主要有酒浸、乳制和滑石粉燙^[48]。1963年版《中國藥典》收載了酒制品和乳制品，以后各版藥典均只收錄了酒蟾酥。由于炮制工藝缺乏規(guī)范化研究，嚴(yán)重影響了蟾酥炮制品的質(zhì)量。以2015年版《中國藥典》收載的酒蟾酥制法為例，“取蟾酥，搗碎，加白酒浸漬，時(shí)常攪動(dòng)至稠膏狀，干燥，粉碎。每10 kg蟾酥，用白酒20 kg”。此工藝只規(guī)定了藥輔比例，但藥材粉碎粒度、輔料用酒、浸漬時(shí)間，干燥溫度和干燥時(shí)間等細(xì)化的工藝參數(shù)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)缺失，難以保證酒蟾酥的質(zhì)量。袁旭江^[58]等采用正交設(shè)計(jì)法，以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基總含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選出酒蟾酥的炮制工藝為用2倍量55 %乙醇在60 ℃下炮制12 h后干燥、粉碎，為建立規(guī)范的蟾酥炮制方法提供了參考依據(jù)。

關(guān)于炮制對(duì)蟾酥飲片質(zhì)量的影響，許多學(xué)者開展了不同的有益嘗試，取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大，結(jié)論尚不統(tǒng)一。葛莉等^[59]對(duì)蟾酥酒制前后的質(zhì)量進(jìn)行比較，酒制后總蟾蜍甾含量有一定程度的升高。付蘭等對(duì)蟾酥藥材及酒浸、牛乳浸和滑石粉燙3種炮制品進(jìn)行質(zhì)量比較，得出相似的結(jié)果，與原料藥材比，炮制品中總蟾蜍甾的含量升高，并且酒制品<牛乳浸制品<滑石粉燙品^[60]。然而，此后類似的研究與這一結(jié)論并不相符。王志巍等^[61]以脂蟾毒配基為指標(biāo)，評(píng)價(jià)蟾酥生品及其酒制品和乳制品的質(zhì)量，結(jié)果為蟾酥生品>酒蟾酥>乳蟾酥。許保軍等^[62]以總蟾蜍甾和脂蟾毒配基為指標(biāo)，評(píng)價(jià)蟾酥生品及其酒制品和滑石粉制品的質(zhì)量，炮制品中總蟾蜍甾和脂蟾毒配基含量明顯降低，其含量為原藥材>酒制品>滑石粉制品。TLC和HPLC指紋圖譜展示的整體化學(xué)模式也提示蟾酥炮制后各成分呈現(xiàn)降低趨勢(shì)^[63-64]。最近更廣泛的研究^[51，65]表明，酒制對(duì)于炮制前后蟾酥中蟾蜍甾和吲哚生物堿基本無影響，對(duì)于乳制和滑石粉燙，除去輔料量增加引起的間接稀釋作用，對(duì)有效成分的含量也是基本無影響。以上研究提示，對(duì)于蟾酥炮制的研究還不深入、系統(tǒng)和規(guī)范。研究結(jié)果偏差較大的原因，可能是檢測(cè)方法與評(píng)價(jià)指標(biāo)不同對(duì)分析結(jié)果的影響，更可能是缺乏規(guī)范化的炮制工藝流程和合適的成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為此，針對(duì)蟾酥炮制工藝開展規(guī)范化研究，揭示其炮制原理、細(xì)化關(guān)鍵工藝過程的技術(shù)參數(shù)，制定生產(chǎn)過程的技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，是保證成品質(zhì)量，進(jìn)而保障其臨床療效的前提。

3 存在問題和展望

蟾酥成分復(fù)雜，其質(zhì)量因基原蟾蜍品種、產(chǎn)地、采收初加工和炮制方法不同而不同。另外據(jù)產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在鮮蟾酥采集和干蟾酥加工過程中，存在“采漿者不加工，出售鮮漿；加工者購買鮮漿直接進(jìn)行加工”的現(xiàn)象。也就是說不同地區(qū)的蟾蜍集中運(yùn)輸至某集散地（比如江蘇南通）采集新鮮蟾酥或者不同產(chǎn)區(qū)（比如河南、山東、四川）直接采漿，冷凍鮮漿運(yùn)輸至集散地進(jìn)行干酥加工，以規(guī)避野生動(dòng)物保護(hù)法規(guī)風(fēng)險(xiǎn)，降低運(yùn)輸成本。這一過程客觀上加劇了商品蟾酥品種混雜、摻雜使假的現(xiàn)象發(fā)生。再者，蟾酥為名貴動(dòng)物藥品種，利益驅(qū)動(dòng)下不良商販主觀故意的摻假、制假行為，是蟾酥偽劣品生產(chǎn)和流通的根本原因。現(xiàn)有蟾酥國家標(biāo)準(zhǔn)僅以指標(biāo)成分華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量判別品質(zhì)優(yōu)劣顯然是不夠的。因此，構(gòu)建全面、識(shí)別度強(qiáng)的蟾酥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，從源頭上保障蟾酥質(zhì)量，是保證臨床用藥安全有效的關(guān)鍵。

蟾酥是國務(wù)院頒布的需要特殊管理的28種毒麻中藥品種之一，也是國家重點(diǎn)保護(hù)的（二級(jí)）野生動(dòng)植物藥材品種之一，它的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)受到國家層面不同程度的重視。除了工信部在蟾酥基地建設(shè)方面的大力資助，在國家發(fā)展和改革委員會(huì)和國家中醫(yī)藥管理局共同組織實(shí)施的“國家中藥標(biāo)準(zhǔn)化”項(xiàng)目中，蟾酥成為受資助的101種臨床最常用飲片之一，也是獲資助的2種中藥大品種麝香保心丸和血栓心脈寧的重要原料藥之一。從蟾蜍的養(yǎng)殖、鮮漿的采集、干酥的初加工、炮制和貯藏等生產(chǎn)全過程開展標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，有助于引領(lǐng)蟾酥產(chǎn)業(yè)的健康有序發(fā)展。然而，由于蟾酥具有毒性和二級(jí)瀕危動(dòng)物藥材雙重屬性^[66-67]，它的生產(chǎn)、銷售和管理涉及到國家相關(guān)政策法規(guī)和生產(chǎn)實(shí)際相沖突的問題。2013年食品藥品監(jiān)管總局等部門《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)中藥材管理的通知 》（食藥監(jiān)〔2013〕208號(hào)）中明確提出“嚴(yán)禁未經(jīng)批準(zhǔn)以任何名義或方式經(jīng)營中藥飲片、中成藥和其他藥品，嚴(yán)禁銷售國家規(guī)定的28種毒性藥材，嚴(yán)禁非法銷售國家規(guī)定的42種瀕危藥材”。事實(shí)上，在蟾酥實(shí)際生產(chǎn)中，鮮漿的采集仍依賴于捕捉野生蟾蜍，而中國青年報(bào)“河南農(nóng)民捕捉87只癩蛤蟆被判3個(gè)月拘役”的新聞時(shí)刻警醒采漿者法律的嚴(yán)肅性；干酥的生產(chǎn)多是藥農(nóng)收購不同產(chǎn)區(qū)的鮮漿之后，以家庭作坊形式進(jìn)行加工和干燥。正視法律法規(guī)與生產(chǎn)實(shí)際的沖突問題并積極尋求有效的解決對(duì)策，是完善蟾酥生產(chǎn)全過程技術(shù)規(guī)范和優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，是推動(dòng)中藥飲片企業(yè)實(shí)現(xiàn)毒性中藥蟾酥標(biāo)準(zhǔn)化量產(chǎn)的原動(dòng)力，進(jìn)而推動(dòng)蟾酥及其中成藥制劑整體質(zhì)量控制水平的提升。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]