SCN1A基因變化在家族性熱性驚厥發(fā)病中的作用

郭嘉誠趙 武

1.蚌埠市第三人民醫(yī)院兒科（安徽蚌埠 233000）；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)科（安徽蚌埠 233000）

SCN1A基因變化在家族性熱性驚厥發(fā)病中的作用

郭嘉誠1趙 武2

1.蚌埠市第三人民醫(yī)院兒科（安徽蚌埠 233000）；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)科（安徽蚌埠 233000）

目的探討SCN1A基因變化在家族性熱性驚厥發(fā)病中的作用。方法收集8個(gè)家族性熱性驚厥家系的臨床資料，留取先證者和部分家系成員的血液標(biāo)本，PCR擴(kuò)增所有先證者SCN1A基因編碼的26個(gè)外顯子及其上下游側(cè)翼序列至少50個(gè)以上堿基，并測序。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的堿基變化，再對(duì)家系其他成員進(jìn)行相應(yīng)外顯子的基因序列篩查，從而明確變異起源。同時(shí)納入200例同年齡正常對(duì)照者加以驗(yàn)證。結(jié)果8例先證者存在33種堿基變化，其中32種被提交為單核苷酸多態(tài)性，一處為新發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變。家系4先證者第15外顯子存在一錯(cuò)義突變（C.2650G＞A），該堿基變化尚未見報(bào)告，且證實(shí)突變遺傳自先證者父親。200名正常對(duì)照者相應(yīng)外顯子測序未發(fā)現(xiàn)該堿基變化。C.2650G＞A導(dǎo)致SCN1A第884位的甘氨酸為絲氨酸所替代（Gly884Ser）。突變位于電壓門控鈉離子通道α亞基第2同源結(jié)構(gòu)域的第4次跨膜和第5次跨膜之間（DIIS4-S5），通過蛋白序列比對(duì)，該氨基酸高度保守。結(jié)論SCN1A基因突變與家族性熱性驚厥的發(fā)病有關(guān)，電壓門控鈉離子通道α亞基電壓感受器（S4）及離子通道孔（S5-S6）外區(qū)突變可能是引起表型相對(duì)較輕的癲癇綜合征的重要原因。

熱性驚厥； SCN1A基因； 家系； 遺傳

熱性驚厥（febrile seizures，F(xiàn)S）是兒童時(shí)期最常見的驚厥性疾病[1]。FS可散發(fā)，也可呈家族聚集性發(fā)病。家系分析顯示FS具有遺傳異質(zhì)性，遺傳方式復(fù)雜，常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和多基因遺傳均有報(bào)道[2]。SCN1A為最重要的癲癇致病基因[3]，然而有學(xué)者對(duì)SCN1A基因突變與家族性FS的相關(guān)性持有爭議[4，5]，國內(nèi)迄今尚未見家族性FS SCN1A基因突變篩查的報(bào)道。本研究對(duì)新發(fā)現(xiàn)的8個(gè)家族性FS家系進(jìn)行遺傳學(xué)監(jiān)測，對(duì)其最重要的癲癇致病基因（SCN1A基因）進(jìn)行篩查，尋找基因突變，并分析突變特點(diǎn)，探討SCN1A基因變化在家族性FS發(fā)生中的作用。

1 臨床資料

8個(gè)家系的先證者（F1-F8）均因FS分別于2013年1月至2013年12月就診于蚌埠市第三人民醫(yī)院。根據(jù)國際抗癲癇聯(lián)盟（ILAE）1993年關(guān)于FS的定義，F(xiàn)S的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)生于1月齡以后的一種癲癇樣發(fā)作，通常與熱性疾病有關(guān)，無中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的證據(jù)，既往無新生兒癲癇或自發(fā)性癲癇病史，也不符合有誘發(fā)因素的急性癥狀性癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。8個(gè)家系患兒均無腦炎、腦膜炎及頭部手術(shù)、外傷史，首次發(fā)作均在1歲以后，無智力發(fā)育延遲，既往也無熱驚厥發(fā)作史，均有明確的熱性驚厥家族史。納入200例同期來院就診的出生地域與病例組相同且無驚厥史的漢族兒童作為正常對(duì)照。其中男112例、女88例，年齡1～4歲。試驗(yàn)方案獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有先證者父母均被告知試驗(yàn)?zāi)康暮脱芯恳饬x，并簽署知情同意書。

通過家系調(diào)查獲得8例先證者詳細(xì)發(fā)病信息，建立家系圖譜（圖1）。8個(gè)家族性熱性驚厥家系，先證者男7例、女1例，中位年齡2.5歲（1～4歲）。8個(gè)家系共20例受累者，男12例、女8例，所有受累者驚厥發(fā)作均在1歲以后，發(fā)作類型幾乎均為全面性強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作（GTCS）；家系中部分成員接受了腦電圖、頭顱CT或腦脊液檢查，未發(fā)現(xiàn)異常；20例受累成員未見無熱驚厥和部分性發(fā)作，無智力損害和發(fā)育遲緩；多數(shù)家系呈常染色體顯性遺傳，且經(jīng)2、3代遺傳，其中家系6先證者（III-1）為熱性驚厥患者，其父母并無熱性驚厥發(fā)作史，但姑姑（II-3）幼時(shí)有熱性驚厥發(fā)作史，且5歲以后未見復(fù)發(fā)，為常染色體隱性遺傳。家系中受累者的主要臨床資料見表1。

圖1 8個(gè)家族性熱性驚厥家系圖譜

表1 家系受累成員臨床資料匯總

采集FS先證者靜脈血2 mL用于SCN1A基因PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測序分析，采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取全血基因組DNA，所提基因組DNA均經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定其純度（OD值）和濃度。①引物設(shè)計(jì)，首先從網(wǎng)上獲得SCN1A基因組全序列（NC_000002.12），用在線Primer3引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并經(jīng)GenBank BLAST驗(yàn)證引物特異性。PCR引物設(shè)計(jì)目標(biāo)：擴(kuò)增SCN1A基因編碼的26個(gè)外顯子及其上下游側(cè)翼序列至少50個(gè)以上堿基。引物序列和擴(kuò)增片段大小見表2。②PCR檢測，采用降落PCR（touchdown PCR，TD-PCR）擴(kuò)增外顯子1～26。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性15 s，62℃退火40 s，72℃延伸l min，以后每個(gè)循環(huán)退火溫度依次降低0.5℃，直到57℃，共11個(gè)循環(huán)。此后，94℃變性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸l min，共24個(gè)循環(huán)。72℃總延伸2 min，反應(yīng)終止后置4℃保存。PCR產(chǎn)物均進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。③產(chǎn)物測序，選取條帶清晰無雜帶的PCR產(chǎn)物10 μL送上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序。④測序結(jié)果分析，應(yīng)用Chromas223軟件，正常序列為GenBank人SCN1A全基因組DNA序列（NC_000002.12），編碼區(qū)序列（CDS_AB093548），蛋白質(zhì)序列（BAC21101），如發(fā)現(xiàn)SCN1A基因堿基變化，對(duì)患兒父母及200例正常對(duì)照者進(jìn)行相應(yīng)片段的PCR擴(kuò)增和測序，以排除單核昔酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）并確定突變來源，必要時(shí)以反向引物進(jìn)行測序驗(yàn)證。

表2 SCN1A基因PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度

8例先證者SCN1A基因測序篩查發(fā)現(xiàn)存在33種堿基變化，通過檢索PubMed SNP數(shù)據(jù)庫及人類基因突變數(shù)據(jù)庫，其中32種被提交SNP，1種為新發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變位點(diǎn)，該堿基變化尚未見報(bào)告，未發(fā)現(xiàn)已被報(bào)道過的突變位點(diǎn)存在突變，先證者F4第15外顯子上存在一錯(cuò)義突變c.2650G＞A（圖2），導(dǎo)致SCN1A基因編碼的氨基酸第884位甘氨酸為絲氨酸所取代（Gly884Ser），所有正常對(duì)照者均未發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)的堿基變化，先證者F4為獨(dú)子，其所在家系共3例受累者，III1（F4）、II2、II4，對(duì)家系其他成員相應(yīng)外顯子進(jìn)行篩查，該突變遺傳自父親（II2）。經(jīng)過蛋白比對(duì)，SCN1A第884位的甘氨酸不僅在人、小鼠、大鼠、斑馬魚、黑猩猩等物種間高度保守（圖3），而且在電壓門控鈉離子通道α亞基單基因家族成員中也是高度保守的（圖4）。經(jīng)網(wǎng)上核實(shí)（http://www.uniprot.org/ uniprot/），Gly884Ser位于電壓門控鈉離子通道第II同源結(jié)構(gòu)域的第4次跨膜和第5次跨膜之間（DIIS4-S5）

圖2 先證者F4（A）SCN1A基因第15外顯子c.2650G＞A突變及正常對(duì)照（B），箭頭所指為突變位點(diǎn)

圖3 不同物種之間SCN1A蛋白質(zhì)序列比對(duì)，884位甘氨酸高度保守

圖4 人電壓門控Na+通道單基因家族成員編碼蛋白序列比對(duì)，884為甘氨酸高度保守高度保守

2 討論

FS具有遺傳異質(zhì)性。一級(jí)親屬FS陽性家族史是FS最常見的危險(xiǎn)因素，且隨有FS病史的一級(jí)親屬人數(shù)的增多危險(xiǎn)性增加，約25%～40%的FS患兒有陽性家族史，F(xiàn)S患兒的同胞發(fā)生FS的危險(xiǎn)為9%～22%，單卵雙胎兒較異卵雙胎兒易于發(fā)生FS[1]。父母雙方有FS病史者其子代發(fā)生FS的危險(xiǎn)較父母單方有FS病史者增加2倍[7]。通過檢索在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），自1996年以來已有12個(gè)家族性FS易感基因座或致病基因被定位或確定，并被OMIM依次被命名為FEB1-FEB11，其中SCN1A被認(rèn)為是最重要的癲癇致病基因[3]。然而由于FS具有高度的遺傳異質(zhì)性，迄今尚未證實(shí)FS特異性的遺傳基因座始終參與FS的發(fā)病[8]。

本研究多數(shù)家系呈常染色體顯性遺傳，且經(jīng)2、3代遺傳，其中家系 6為常染色體隱性遺傳，經(jīng)SCN1A基因篩查，未發(fā)現(xiàn)該家系存在基因突變，僅在家系 4第15外顯子發(fā)現(xiàn)一錯(cuò)義突變c.2650G＞A，證實(shí)了FS的遺傳異質(zhì)性。分析原因，一方面可能還有其他致病基因或環(huán)境因素參與FS的發(fā)??；另一方面，文獻(xiàn)報(bào)道，SCN1A基因SNP可能會(huì)增加FS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，如本研究發(fā)現(xiàn)的rs3812718（SCN1A IVS5N+5G＞A）。大樣本對(duì)照研究顯示，rs3812718與癲癇的發(fā)病存在強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)，等位基因G與A比值比（OR）=0.85，P= 0.0009，基因型GG與基因型AA的OR=0.73，P= 0.003[9]。OR在不同種族間從0.76到0.87。這種關(guān)聯(lián)在印第安人群和熱性驚厥患者中尤為明顯。等位基因G可影響SCN1A基因的拼接和電壓門控鈉離子通道從失活狀態(tài)恢復(fù)的速度，由于SCN1A優(yōu)先在中樞抑制性神經(jīng)元表達(dá)，作者認(rèn)為等位基因G可能降低癲癇的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

SCN1A基因編碼電壓門控鈉離子通道，在控制動(dòng)物細(xì)胞電興奮性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它由1個(gè)高度保守的α亞基和2個(gè)輔助的β亞基（β1，β2）組成，α亞基是鈉通道的主要功能區(qū)域，該亞基由4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（DI-DIV）組成。每一個(gè)同源結(jié)構(gòu)域含有6個(gè)跨膜片段，分別命名為S1-S6，其中S4為電壓感受器，其氨基酸殘基富含正電荷，在序列上最為保守，在調(diào)控通道正常功能中起重要作用，S5和S6構(gòu)成部分離子通道孔，是離子通道最為重要的組成部分[10]。人電壓門控Na+通道是一個(gè)單基因家族，有不同的亞型，包括 Nav1.1-Nav1.9，分別由 SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN5A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A基因編碼，其中只有SCN1A、SCN2A、SCN3A和SCN8A在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)[11]，2000年 Escayg等[12]首次報(bào)道在全面性癲癇伴熱性驚厥附加征（GEFS+）家系中發(fā)現(xiàn)SCN1A基因突變，隨后的10余年間，已有700余例SCN1A突變相繼報(bào)道[13]。國內(nèi)學(xué)者對(duì)SCN1A基因的研究也越來越多，新的突變位點(diǎn)也不斷被發(fā)現(xiàn)，如c.2592G＞A，c.1212G＞A[14]等，其所致疾病譜從表型較輕的GEFS+[12]、部分性癲癇伴熱性驚厥附加征（PEFS+）[15]，到嚴(yán)重的嬰兒重癥肌陣攣性癲癇（SMEI）[16]均有發(fā)現(xiàn)，這種表型的多樣性、復(fù)雜性與SCN1A 突變的位置、類型及功能學(xué)改變有關(guān)。

遺傳學(xué)研究表明，表型較重的SMEI以SCN1A錯(cuò)義突變和蛋白截短突變?yōu)橹鳎掖蠖辔挥陔妷焊惺軈^(qū)（S4）和孔區(qū)（S5-S6）；而癥狀相對(duì)較輕的GEFS+、PEFS+則以孔區(qū)外的錯(cuò)義突變?yōu)橹鱗17]。本研究在家系4發(fā)現(xiàn)的Gly884Ser位于電壓門控鈉離子通道α亞基第II個(gè)同源結(jié)構(gòu)域的第4次跨膜和第5次跨膜之間（DIIS4-S5），此位點(diǎn)避開了鈉離子通道重要的電壓感受器區(qū)（S4）和通道孔的形成區(qū)（S5-S6），該家系患者所呈現(xiàn)的臨床癥狀與鑒定出的SCN1A突變特點(diǎn)相吻合，表型較輕，僅表現(xiàn)為簡單的熱性驚厥發(fā)作。

SCN1A 基因不同位點(diǎn)、不同類型的突變對(duì)鈉通道功能的影響不同，可以引起鈉通道功能增加或缺失，使離子通道的興奮性增加或降低，從而導(dǎo)致不同的癲癇表型，Mantegazza等[4]對(duì)一個(gè)有12例簡單型FS患者的意大利4代家系進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)SCN1A基因α亞單位同源結(jié)構(gòu)域I第1個(gè)跨膜片段（D1S1）存在一雜合錯(cuò)義突變（p.M145T），第145位的蛋氨酸被蘇氨酸替換，哺乳動(dòng)物細(xì)胞功能研究證實(shí)p.M145T是一個(gè)功能缺失突變體，從而證實(shí)SCN1A基因功能缺失突變與家族性簡單型FS有關(guān)。Lossin等[18]在對(duì)GEFS+家系的3個(gè)突變體體外電生理研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)突變體（T875M,W1204R, R1648H.）都能改變鈉離子通道的滅活過程，導(dǎo)致持久性的鈉離子內(nèi)流增加，這種功能性增加突變體通過引起細(xì)胞膜的持久性去極化進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞膜的興奮性，從而導(dǎo)致癲癇發(fā)作。即使是同一位點(diǎn)的突變，其氨基酸殘基置換的不同亦可導(dǎo)致不同的電生理學(xué)改變，引起不同的癲癇類型，如均是1648位精氨酸殘基發(fā)生突變，R1648C比R1648H有更明顯的持續(xù)電流，從而導(dǎo)致前者出現(xiàn)SMEI癥狀，而后者則表現(xiàn)為PEFS+[19]。本研究經(jīng)過蛋白序列比對(duì)，SCN1A基因第884位的甘氨酸在進(jìn)化上高度保守，提示在電壓門控鈉離子通道的生理功能中可能發(fā)揮重要作用，甘氨酸為非極性疏水性氨基酸，絲氨酸為極性中性氨基酸，二者屬于不同類的氨基酸，氨基酸的這種變化可能對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生顯著影響。故SCN1A的突變位點(diǎn)、類型對(duì)電壓門控鈉離子通道蛋白的結(jié)構(gòu)、電生理學(xué)屬性的影響及其與癲癇臨床表型的相互關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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Role of SCN1A gene variations in the development of familial febrile seizures

GUO Jiacheng1，ZHAO Wu2(1.Department of Pediatrics，The Third People's Hospital of Bengbu，Bengbu 233000，Anhui，China；2.Department of Pediatrics，The First Af fi liated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，Anhui，China)

ObjectiveTo determine the role of SCN1A gene variation in the development of familial febrile seizures（FS）.MethodsClinical data were collected from 8 familial FS pedigrees, and peripheral venous blood samples were collected from the probands and other available family members.All 26 coding exons and exon-intron boundaries at least 50 bases of the human SCN1A gene were ampli fi ed by polymerase chain reaction, the products were subsequently sequenced.To novo variation, other family members were screened for the corresponding exons.Two hundred age-matched healthy children were served as normal controls.ResultsA total of 33 variations in the SCN1A gene were identi fi ed in these families.Of these variations, one was a missense mutation; the remaining 32 variations were previously submitted as single nucleotide polymorphisms (SNPs).A c.2650G＞A heterozygous missense mutation in exon 15 of the SCN1A gene found in the proband of family 4 was inherited from his father who had seizures with fever in early childhood.The c.2650G＞A mutation was absent in the 400 alleles of normal controls.To the best of our knowledge, the SCN1A c.2650G＞A mutation has neither been reported in the NCBI SNP database nor in the literature to date.The c.2650G＞A mutation changes a glycine at amino acid 884 in the SCN1A protein to a serine (p.Gly884Ser).Protein sequence analysis showed that the p.Gly884Ser is located at a highly conserved region between the 4th and 5th transmembrane segment of the homologous domain II of voltage-gated sodium channel 1 subunit (DIIS4-S5).ConclusionsThe pathogenesis of familial febrile seizures was related to the SCN1A variation, the mutation outside the region of the voltage sensor (S4) and ion channel pore (S5-S6) of the voltage gated sodium channel α-subunit may be an important factor to cause mild phenotype epilepsy syndrome.

febrile seizures; SCN1A genes; family; heredity

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.02.014

2015-04-03)

(本文編輯：蔡虹蔚)

趙武 電子信箱：bbyxyzhaowu@126.com