接種發(fā)酵對酸菜品質的影響

孟繁博張萬萍 吳康云

(1. 貴州省現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽 550006；2. 貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省園藝研究所，貴州 貴陽 550006)

接種發(fā)酵對酸菜品質的影響

孟繁博1張萬萍2吳康云3

(1. 貴州省現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽 550006；2. 貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省園藝研究所，貴州 貴陽 550006)

以青菜為原料，選用鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌3種乳酸菌進行人工接種試驗，設計了7個配方，發(fā)酵時間為8 d，研究發(fā)酵菌種對酸菜總酸含量和亞硝酸鹽含量的影響，確定最適合酸菜發(fā)酵的菌種，并研究接種發(fā)酵對酸菜的氨基酸含量和揮發(fā)性風味物質成分的影響。結果表明，當鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比例為1∶1∶1時，酸菜總酸含量升高最快，亞硝酸鹽含量最低且無明顯的亞硝峰出現(xiàn)，為最適合酸菜發(fā)酵的菌種。接種發(fā)酵酸菜的氨基酸種類和含量均高于自然發(fā)酵的酸菜，揮發(fā)性風味物質成分的種類和相對含量均低于自然發(fā)酵的酸菜。

酸菜；品質；接種；發(fā)酵

酸菜是由蔬菜經(jīng)乳酸發(fā)酵而成[1]，清爽可口、風味獨特，被廣泛用于多種地方特色菜肴的烹飪，深受人們喜愛。中國傳統(tǒng)的酸菜制作方法大都采用自然發(fā)酵，此方法利用蔬菜表面附著的多種微生物進行發(fā)酵，其中包括大量雜菌，對乳酸菌和一些有益微生物生長繁殖起到抑制作用，存在亞硝酸鹽含量較高、發(fā)酵周期較長以及品質不穩(wěn)定等問題，制約了酸菜發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。眾多研究表明，人工接種乳酸菌發(fā)酵酸菜能夠降低酸菜的亞硝酸鹽含量[2-4]，縮短發(fā)酵時間[5-6]，提高生產(chǎn)效率[7]，并對酸菜的氨基酸含量和揮發(fā)性風味成分[8-10]等品質指標均有影響。目前，關于接種發(fā)酵對四川泡菜品質影響的相關研究較多，劉春燕等[11]進行了不同乳酸菌接種發(fā)酵泡菜風味的研究，侯曉艷[12]研究了不同乳酸菌發(fā)酵對泡蘿卜品質的影響。然而關于接種發(fā)酵對酸菜品質的影響鮮有報道。因此，本試驗選用青菜為原料，通過人工接種乳酸菌的方式，從7個乳酸菌配方中選出適合酸菜發(fā)酵的菌種，并對接種發(fā)酵和自然發(fā)酵的酸菜品質進行對比，以研究接種乳酸菌發(fā)酵對酸菜品質的影響，旨在為酸菜產(chǎn)業(yè)的質量穩(wěn)定和大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青菜：品種四月青，貴州李記食品有限公司；

鼠李糖乳桿菌6134、嗜酸乳桿菌6243和發(fā)酵乳桿菌6233：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；

MRS培養(yǎng)基：北京陸橋技術有限責任公司；

純化瓊脂粉：上海博微生物科技有限公司；

電子天平：FA2204B型，上海精科天美科學儀器有限公司；

紫外分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限責任公司；

冷凍離心機：TGL20M型，長沙邁佳儀器設備有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-150B-Z型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

單人單面凈化工作臺：SW-CJ-IFD型，蘇州凈化設備有限公司；

高壓滅菌鍋：LS-375L-I型，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；

全自動氨基酸分析儀：L-8900型，日本日立公司；

GC/MS聯(lián)用儀：HP6890/5975C型，美國安捷倫公司；

手動固相微萃取裝置：57300-U，美國Supelco公司；

萃取纖維頭：57329-U，美國Supelco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酸菜發(fā)酵工藝 選取新鮮青菜進行清洗、晾曬和切分，試驗均選用2 L菜壇，每壇放入相同重量的青菜和鹽水(料液質量比為1∶3)，食鹽添加量為4%，同時加入發(fā)酵菌懸液，菜壇口用水密封，進行發(fā)酵。

1.2.2 菌懸液的制備 將鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌3種乳酸菌凍干菌種分別用MRS培養(yǎng)基轉管活化三代，分別取兩環(huán)活化后的乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，通過離心分離(5 000 r/min)集菌，并且用0.85%生理鹽水懸浮，配制3種乳酸菌菌懸液，乳酸菌數(shù)均為108～109CFU/mL[13]。

1.2.3 發(fā)酵菌種的選擇 試驗選用2 L容量的菜壇，配制食鹽添加量為4%的鹽水，每壇放入相同重量的青菜和鹽水(料液質量比為1∶3)?；趯嶒炇抑暗难芯?，鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌具有產(chǎn)酸和降解亞硝酸鹽的能力，在酸菜生產(chǎn)中廣泛應用，因此試驗選擇這3種乳酸菌用于酸菜發(fā)酵試驗。以自然發(fā)酵的酸菜為空白對照，分別接入發(fā)酵菌種，結合前期的試驗研究，選用單一乳酸菌、3種乳酸菌兩兩以1∶1的比例組合以及3種乳酸菌以1∶1∶1的比例組合，接種量為3%。以酸菜的總酸含量和亞硝酸鹽含量為指標，每天測定一次，測定時間為8 d，研究不同發(fā)酵菌種對酸菜中總酸含量和亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.4 理化指標的測定

(1) 亞硝酸鹽含量：按GB 5009.33—2010執(zhí)行。

(2) 總酸含量：按GB/T 12456—2008執(zhí)行。

(3) 氨基酸含量：按GB/T 5009.124—2003執(zhí)行。

1.2.5 酸菜的揮發(fā)性風味物質成分測定 取兩種酸菜樣品約10 g，分別置于20 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在85 ℃條件下頂空萃取30 min后取出，快速移出萃取頭并立即插入溫度為250 ℃的氣相色譜儀進樣口中，熱解析3 min進樣。

(1) 氣相色譜分析條件：色譜柱為AB-INowax (30.0 m×250 μm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫45 ℃(保留2 min)，以4 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓0.052 5 MPa，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間：1.5 min。

(2) 質譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 618 V；接口溫度280 ℃；質量范圍20～450 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過對總離子流圖中的各峰經(jīng)質譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并對Nist 2005和Wiley 275標準質譜圖進行核對，確定自然發(fā)酵和接種發(fā)酵下發(fā)酵的酸菜中揮發(fā)性風味成分，用峰面積歸一化法確定各成分的相對質量分數(shù)。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵菌種對酸菜總酸含量的影響

由圖1可知，在發(fā)酵過程中，酸菜的總酸含量隨著發(fā)酵時間的延長呈上升趨勢，接種乳酸菌發(fā)酵酸菜的產(chǎn)酸速度均大于自然發(fā)酵，且總酸含量高于自然發(fā)酵處理。在發(fā)酵的第1天，酸菜中總酸含量變化不明顯，可能是在發(fā)酵初期乳酸菌未能適應發(fā)酵環(huán)境并且發(fā)酵液中仍有其它微生物生長，導致乳酸菌含量不高，酸菜中總酸含量上升緩慢，從第2天開始，乳酸菌大量繁殖，酸菜中的總酸含量明顯上升。首先，鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比例為1∶1∶1時，酸菜的總酸含量上升最快，其次，兩菌種混合發(fā)酵酸菜的總酸含量上升速度快于單一菌種發(fā)酵的酸菜。不同菌種發(fā)酵的酸菜中總酸含量變化趨勢基本一致，總酸含量逐漸上升并達到穩(wěn)定，這是因為隨著酸菜發(fā)酵時間的延長，乳酸菌大量繁殖，酸菜的總酸含量隨之增加。由于接種乳酸菌發(fā)酵酸菜能使乳酸菌快速成為優(yōu)勢菌，乳酸菌含量高于自然發(fā)酵處理，導致接種乳酸菌發(fā)酵酸菜的產(chǎn)酸速度和總酸含量均大于自然發(fā)酵處理，而當酸菜的總酸含量上升到一定程度，乳酸菌的生長便受到了抑制，酸菜中總酸含量的上升速度變慢，并逐漸趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵第8天時，鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比例為1∶1∶1發(fā)酵的酸菜，總酸含量最高。這可能是鼠李糖乳桿菌發(fā)酵初期產(chǎn)酸較慢，但其具有很強的耐酸能力，在發(fā)酵中后期產(chǎn)酸量大；嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸快，并且耐酸能力較強[14]，而發(fā)酵乳桿菌在發(fā)酵初期產(chǎn)酸速度快，但是耐酸能力弱，到發(fā)酵后期產(chǎn)酸速度有所下降。因此，在接種量均為3%時，鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌混合發(fā)酵酸菜中的總酸含量最高。

2.2 發(fā)酵菌種對酸菜中亞硝酸鹽含量的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，不同處理的酸菜中亞硝酸鹽含量均呈先升高后降低的趨勢。接種發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量上升緩慢，在發(fā)酵2 d時達到高峰，其中鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比例為1∶1∶1發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量最低，兩種乳酸菌混合發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽的峰值低于單一乳酸菌發(fā)酵處理，而自然發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量上升速度快，在發(fā)酵3 d時達到最高，且峰值明顯高于接種乳酸菌發(fā)酵的酸菜。在發(fā)酵8 d時，3種乳酸菌混合發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量最低，自然發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量最高。在發(fā)酵過程中，自然發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量始終高于接種乳酸菌發(fā)酵的酸菜，在發(fā)酵8 d時，鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比例為1∶1∶1發(fā)酵酸菜的亞硝酸鹽含量最低，僅為6.05 mg/kg，且無明顯的亞硝峰出現(xiàn)，具有良好的食用安全性。這可能是3種乳酸菌對亞硝酸鹽均有降解能力，但是在不同的發(fā)酵階段不同菌種對亞硝酸鹽的降解率是不同的，因此，在接種量均為3%時，鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌混合作為發(fā)酵菌種時，能將酸菜的亞硝酸鹽含量始終維持在較低水平。

綜合以上考慮，以酸菜的總酸含量和亞硝酸鹽含量為考察指標，選擇鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比例為1∶1∶1作為酸菜發(fā)酵菌種，并用于后面的研究。

2.3 接種發(fā)酵與自然發(fā)酵酸菜中氨基酸含量的對比

接種發(fā)酵和自然發(fā)酵的酸菜中氨基酸測定圖譜見圖3。由圖3可知，兩種酸菜的氨基酸譜圖很相似，說明兩種酸菜的氨基酸組成很相近。由表1可知，接種發(fā)酵與自然發(fā)酵的酸菜中均含有豐富的氨基酸，其中接種發(fā)酵的酸菜中檢測出17種氨基酸，氨基酸總量為8.78 mg/kg，自然發(fā)酵的酸菜中檢測出16種氨基酸，氨基酸總量為6.19 mg/kg。兩種酸菜中的組氨酸和門冬氨酸含量較高，接種發(fā)酵的酸菜中組氨酸和門冬氨酸含量分別為2.05 mg/kg和2.14 mg/kg，分別占總氨基酸含量的23.35%和24.37%。其中，門冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甘氨酸對于酸菜形成良好風味起著重要的作用，而接種發(fā)酵的酸菜中這幾種氨基酸的含量均高于自然發(fā)酵的酸菜。接種發(fā)酵的酸菜中檢測出了自然發(fā)酵酸菜所沒有的谷氨酸，谷氨酸和門冬氨酸為植物性鮮味食物的主要呈鮮物質，具有較強的鮮味，因此接種發(fā)酵酸菜味道更加鮮美，營養(yǎng)更豐富。

Figure 3 Fingerprint of amino acids in pickled mustard under optimized fermentation and natural fermentation

2.4 接種發(fā)酵與自然發(fā)酵的酸菜中揮發(fā)性風味成分的對比

酸菜的揮發(fā)性風味物質總離子圖見圖4。

Figure 4 Total ion chromatogram of volatile flavor components in pickled mustardunder optimized fermentation and natural fermentation

由表2可知，接種發(fā)酵和自然發(fā)酵的酸菜中共檢出揮發(fā)性風味成分68種，主要包括酯類、醇類、烷烴類、烯烴類、醛類、含硫化合物、酮類、酸類和腈類等。接種發(fā)酵酸菜的風味成分種類和相對含量都略小于自然發(fā)酵的酸菜。

由表3可知，接種發(fā)酵的酸菜中檢出58種風味成分，風味成分相對含量為96.89%，其中包括酯類12種、醇類6種、烷烴類1種、烯烴類4種、醛類14種、含硫化合物7種、酮類4種、酸類4種、腈類2種和其它種類4種。自然發(fā)酵的酸菜中檢出61種風味成分，風味成分相對含量為97.95%，其中包括醛類15種、酯類13種、醇類6種、烷烴類5種、含硫化合物5種、酮類5種、烯烴類4種、腈類3種、酸類1種和其它種類4種。

兩種酸菜的揮發(fā)性風味成分中，酯類化合物的相對含量最高，其中異硫氰酸烯丙酯為兩種酸菜的最主要風味成分，相對含量分別為62.78%和56.22%，其次，接種發(fā)酵酸菜中異硫氰酸仲丁酯(4.10%)、異硫氰酸異丁酯(1.19%)、3-丁烯基異硫氰酸酯(4.65%)、異硫氰酸戊酯(2.02%)、異硫氰酸苯乙酯(4.17%)和自然發(fā)酵的酸菜中異硫氰酸仲丁酯(5.86%)、異硫氰酸異丁酯(1.97%)、3-丁烯基異硫氰酸酯(4.51%)、異硫氰酸戊酯(2.84%)、異硫氰酸苯乙酯(4.33%)的相對含量也很高，同樣也是組成酸菜中揮發(fā)性風味的主要成分。有研究[15]表明，異硫氰酸酯類物質是以芥菜為原料發(fā)酵酸菜的特征風味，在酸菜發(fā)酵的過程中，芥菜中芥子苷通過水解作用生成具有刺激性、辛辣味和芳香味的異硫氰酸酯，經(jīng)檢測，自然發(fā)酵的酸菜中酯類化合物和異硫氰酸酯類物質的相對含量高于接種發(fā)酵的酸菜，可能是接種發(fā)酵酸菜時接種了乳酸菌，而乳酸菌能夠降低芥菜中的異硫氰酸酯含量，降低了酸菜中的刺激性氣味，使酸菜的氣味具有較好的接受性。

接種發(fā)酵和自然發(fā)酵的酸菜中揮發(fā)性風味成分種類大多相同，接種發(fā)酵酸菜中僅檢出1種烷烴，為2,2,6-三甲基環(huán)庚烷，而自然發(fā)酵酸菜中檢出5種烷烴，分別為2,2,6-三甲基環(huán)庚烷、3-甲基-正十五烷、十六烷、十七烷和十八烷。接種發(fā)酵酸菜中檢出7種含硫化合物，分別為二硫化碳、二甲基二硫、烯丙基甲基二硫醚、二甲基三硫、甲基烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫和1,4-二甲基四硫，而自然發(fā)酵酸菜中檢出5種含硫化合物，較自然發(fā)酵酸菜少了二烯丙基二硫和1,4-二甲基四硫。含硫化合物對酸菜的風味有較大貢獻。接種發(fā)酵酸菜中檢出4種酮類成分，分別為5-甲基-2-己酮、反式異胡薄荷酮、順式-3-甲基-5-亞戊基-2(5H) -呋喃酮、香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮，而自然發(fā)酵酸菜中檢測出5種酮類成分，較接種發(fā)酵的酸菜多了5-甲基-2-己酮。接種發(fā)酵下發(fā)酵的酸菜中檢出4種酸類物質，分別為乙酸、辛酸、苯甲酸和脫氫乙酸。而自然發(fā)酵的酸菜中揮發(fā)性風味物質中僅檢出乙酸1種酸類物質。腈類物質是以卷心菜為代表的蔬菜風味成分，接種發(fā)酵的酸菜中檢出腈類2種，為3-丁烯腈和苯代丙腈，自然發(fā)酵的酸菜中檢出腈類有3種，較接種發(fā)酵酸菜多了苯乙腈。2-乙基噻吩僅在接種發(fā)酵的酸菜中檢出，甲氧基苯基肟僅在自然發(fā)酵的酸菜中檢出。

3 結論

通過研究接種發(fā)酵對酸菜品質的影響，發(fā)現(xiàn)當鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的比例為1∶1∶1作為發(fā)酵菌種發(fā)酵酸菜時，酸菜的總酸含量最高，亞硝酸鹽含量最低。接種發(fā)酵和自然發(fā)酵的酸菜中均含有豐富的氨基酸，接種發(fā)酵的酸菜中檢測出了自然發(fā)酵酸菜所沒有的谷氨酸，使酸菜的風味更佳，營養(yǎng)更豐富。接種發(fā)酵和自然發(fā)酵的酸菜中共檢出揮發(fā)性風味成分68種，其中自然發(fā)酵酸菜中檢出61種風味成分，風味成分相對含量為97.95%，接種發(fā)酵酸菜中檢出58種風味成分，風味成分相對含量為96.89%。兩種酸菜中酯類化合物的相對含量最高，其中異硫氰酸烯丙酯為酸菜的最主要風味成分，相對含量分別為62.78%和56.22%。因此，人工接種不僅能加快酸菜的產(chǎn)酸速度，提高總酸含量、降低亞硝酸鹽含量，而且對酸菜的風味物質種類和含量也有一定的影響。

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Influence of vaccinated lactobacillus on quality of pickled mustard

MENG Fan-bo1ZHANGWan-ping2WUKang-yun3

(1.GuiZhouInstituteofIntegratedAgriculturalDevelopment,Guiyang,Guizhou550006,China; 2.SchoolofAgriculture,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 3.GuiZhouProvinceHorticultureResearchInstitute,Guiyang,Guizhou550006,China)

The effect of vaccinated lactobacillus on content of total acids and nitrite in pickled mustard vaccinatedL.rhamnosus,L.acidophilus,L.fermentumand their combination was detected in this paper. The influence of fermentation by inoculating the optimal strain combination on content of amino acids and volatile flavor compounds was performed as well. The content of total acid and nitrite in pickled mustard vaccinated a strain combination(L.rhamnosus∶L.acidophilus∶L.fermentum=1∶1∶1) showed the optimum results. It was found that the vaccinated fermentation was superior to the nature fermentation based on kinds and content of amino acids while those of volatile flavor compounds were less in the former.

pickled mustard; quality; vaccination; fermentation

農業(yè)科技合作專項計劃項目(編號：2013-02)；黔科合重大專項(編號：﹝2013﹞6007)；黔農科院自主創(chuàng)新專項(編號：﹝2014﹞016)

孟繁博，女，貴州省現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展研究所助理研究員，碩士。

張萬萍(1970—)，女，貴州大學教授，博士。 E-mail: zwp269@126.com

2016-12-13

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.037