張 杰，鄭 慧，盧仁泉，郭 林

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

不同HER-2表達水平對乳腺癌細胞生物學行為的影響

張 杰，鄭 慧，盧仁泉，郭 林

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

背景與目的：人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)屬于受體酪氨酸激酶中的生長因子受體家族，其表達差異在乳腺癌靶向藥物的臨床使用中起決定作用。該研究旨在篩選出HER-2不同表達水平的乳腺癌細胞株，研究HER-2表達差異對腫瘤細胞生物學行為的影響。方法：對乳腺癌細胞系SK-BR-3進行克隆純化，利用德國西門子公司ADVIA Centuar CP系統(tǒng)電化學發(fā)光技術(shù)檢測細胞培養(yǎng)上清液中可溶性HER-2(soluble HER-2, sHER-2)的表達水平，篩選出sHER-2高表達細胞株(大于50.0 ng/mL)、中表達細胞株(15.8～50.0 ng/mL)及低表達細胞株(小于15.8 ng/mL)。通過細胞培養(yǎng)觀察以上3種乳腺癌細胞株的形態(tài)學變化，并通過一系列體外實驗比較細胞的生物學特性，包括克隆形成實驗、劃痕實驗和Transwell檢測等。結(jié)果：與正常乳腺上皮細胞相比，乳腺癌細胞系SK-BR-3表達的sHER-2水平明顯增高。其中，sHER-2高表達細胞株的克隆形成率為(51.3±3.4)%，明顯高于中表達細胞株［(42.0±3.7)%］和低表達細胞株［(26.7±2.9)%］；sHER-2高表達細胞株的遷移率為(50.0%±0.6)%，明顯高于sHER-2中表達細胞株［(19.5±3.4)%］和sHER-2低表達細胞株［(13.6±1.0)%］；sHER-2高表達細胞株的侵襲能力為(53.5±4.2)%也明顯比sHER-2中表達細胞株［(33.2±3.9)%］和低表達細胞株［(28.9±5.4)%］細胞株強，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論：乳腺癌sHER-2高表達細胞株具有促增殖、促細胞動力等生物學效應，因此能為臨床合理使用乳腺癌靶向藥物提供參考依據(jù)。

乳腺癌；可溶性人表皮生長因子受體-2；細胞侵襲；增殖；遷移

乳腺癌是危害女性健康最常見的惡性腫瘤，且其死亡率呈明顯上升趨勢。人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是一種與細胞的增殖和分化有關(guān)的上皮生長因子受體，在多種正常組織中低表達。前期研究證實，有25%～30%的乳腺癌患者HER-2基因高表達［1］。還有研究表明18%～20%乳腺癌患者體內(nèi)血清可溶性HER-2(soluble HER-2，sHER-2)過高表達與乳腺癌患者的預后復發(fā)及治療方案均有關(guān)系，提示預后差，容易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，其表達水平的檢測已作為一個獨立指標用于對腫瘤生物學行為的判斷［2］。本研究通過建立不同sHER-2表達水平的乳腺癌細胞株，并且對其生物學特性進行研究，不但可以為研究sHER-2過表達與乳腺癌治療方面相關(guān)性提供理想的細胞模型，而且還能為乳腺癌個體化治療奠定基礎(chǔ)。目前HER-2基因及蛋白表達的研究主要采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、免疫組織化學檢測、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和ADVIA Centaur檢測等。本研究利用FISH與ADVIA Centaur檢測的方法進行分析、探討。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞系SK-BR-3來自美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)，正常人乳腺上皮細胞由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌研究中心惠贈。通過化學發(fā)光的方法進行檢測細胞培養(yǎng)液上清液中sHER-2的表達水平，檢測儀器為ADVIA Centuar CP，購自德國西門子公司。細胞培養(yǎng)所需試劑包括DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶及青、鏈霉素雙抗均購自美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及sHER-2測定

細胞在包含15%胎牛血清和含青、鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液中生長，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)，待對數(shù)生長期的細胞匯合度達到70%～80%，吸出培養(yǎng)液，檢測培養(yǎng)液中sHER-2值。

1.3 sHER-2不同表達細胞株篩選

取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞，每孔接種100個細胞于24孔板上，每24～48 d后傳代1次，共10次。對傳代細胞培養(yǎng)液進行sHER-2濃度檢測(共24個孔)，并篩選出高、中和低表達水平的細胞克隆進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞，共3組(sHER-2高表達組、中表達組和低表達組)，每孔接種100個細胞于6孔板上，待細胞數(shù)達50%生長融合時，用FISH法進行驗證。

1.4 平板克隆形成實驗測定細胞克隆形成率

取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞，共3組(sHER-2高表達組、中表達組和低表達組)，每孔接種100個細胞于6孔板上，10～14 d后終止培養(yǎng)。固定、染色后，顯微鏡下計數(shù)有效克隆數(shù)(超過50個細胞數(shù)的克隆為有效克隆)并計算克隆形成率。克隆形成率(%)＝克隆數(shù)/實際接種細胞數(shù)×100%，每組設(shè)3個復孔。

1.5 細胞劃痕實驗判斷細胞生長能力

取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞，共3組(sHER-2高表達組、中表達組和低表達組)，以每孔105個接種于24孔板，待細胞數(shù)達50%生長融合時，用移液槍頭沿培養(yǎng)板底部呈一字型劃痕，分別于培養(yǎng)1和48 h時倒置顯微鏡下測量劃痕的寬度。細胞遷移率(%)=(1-測量時劃痕寬度/初始劃痕寬度) ×100%。重復試驗4次［3］。

1.6 Transwell試驗檢測細胞侵襲能力

取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞，共3組(sHER-2高表達組、中表達組和低表達組)，每孔接種5 000個細胞于Transwell孔板內(nèi)。24～36 d后終止培養(yǎng)。固定、染色后，在顯微鏡下觀察細胞穿孔情況并進行計數(shù)。相對細胞侵襲率(%)=穿透細胞總數(shù)/5 000×100%。

1.7 CA153的檢測方法

使用電化學發(fā)光法進行檢測，使用儀器為羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司COBAS 600(CA153使用國際單位U/mL)。

1.8 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，細胞生長及存活曲線用SigmaPlot 10.0統(tǒng)計軟件擬合，圖表使用GraphPad Prism軟件繪制。計量資料用表示，采用t檢驗和方差分析比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌細胞系sHER-2水平明顯增高

乳腺癌細胞系SK-BR-3和正常乳腺上皮細胞均培養(yǎng)至對數(shù)生長期，吸出培養(yǎng)液，檢測培液中sHER-2表達水平。SK-BR-3細胞培養(yǎng)上清液中sHER-2濃度為(51.9±4.4)ng/mL，明顯高于對照組正常乳腺上皮細胞(10.0±1.8)ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1)。

圖 1 兩組細胞株之間sHER-2表達水平的比較Fig. 1 The comparison of sHER-2 expression levels between the two groups of cell lines

2.2 乳腺癌細胞系SK-BR-3中sHER-2不同濃度表達細胞株建立

將SK-BR-3細胞系經(jīng)克隆化培養(yǎng)，得到不同sHER-2表達濃度的細胞株。將15.8 ng/mL作為sHER-2最佳的cut-off值具有99.1%的特異度和16.1%的靈敏度，小于15.8 ng/mL的細胞株作為sHER-2低表達株；15.8～50.0 ng/mL的細胞株作為sHER-2中表達株；大于50.0 ng/mL的細胞株作為sHER-2高表達株［4］。

將上述克隆純化后培養(yǎng)的3株sHER-2不同表達水平細胞株再利用FISH法進行驗證，F(xiàn)ISH檢測結(jié)果與ADVIA Centaur法檢測細胞培養(yǎng)上清液中sHER-2濃度結(jié)果相一致(圖2)。

圖 2 sHER-2高、中和低表達乳腺癌細胞株建立Fig. 2 Establishment of breast cancer cell clones with high, medium and low sHER-2 expression

2.3 細胞克隆形成率的檢測

sHER-2高表達、中表達和低表達細胞株克隆形成率分別為(51.3±3.4)%、(42.0±3.7)%和 (26.7±2.9)%，sHER-2高表達組細胞的克隆形成能力明顯高于其他兩組細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)。

圖 3 高、中和低表達細胞染色后的鏡下克隆Fig. 3 The image of cell clones with high, medium and low sHER-2 expression concentration

2.4 細胞生長能力比較

劃痕后培養(yǎng)1 h時，sHER-2高表達組細胞sHER-2高表達細胞株遷移率與中、低兩組細胞差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。48 h后，發(fā)現(xiàn)sHER-2高表達細胞株的生長能力明顯強于中、低兩組細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1，圖4)。

表 1 sHER-2不同表達水平對細胞遷移能力的影響Tab. 1 The effect of sHER-2 expression level on cell mobility

表 1 sHER-2不同表達水平對細胞遷移能力的影響Tab. 1 The effect of sHER-2 expression level on cell mobility

*: P＜0.05, as compared with other two groups

Group 1 h 48 h Mobility sHER-2 high expression 20.5±1.3 10.3±1.0 (50.0±0.6)%*sHER-2 medium expression 21.3±1.1 16.3±1.8 (19.5±3.4)% sHER-2 low expression 20.5±1.7 17.5±1.3 (13.6±1.0)%

2.5 細胞侵襲能力比較

本研究通過Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)SKBR-3細胞系中分選出來的sHER-2高表達細胞株的穿膜率為(53.5±4.2)%，明顯強于sHER-2高表達細胞株［(33.2±3.9)%］和sHER-2低表達細胞株［(28.9±5.4)%］，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖5)。

2.6 sHER-2檢測與CA153檢測情況比較

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、中和低表達組sHER-2檢測結(jié)果與CA153檢測結(jié)果呈正相關(guān)(圖6)。

3 討 論

乳腺癌是我國最常見的女性惡性腫瘤，發(fā)展迅速，發(fā)病率更是位居女性癌癥首位?；熌退幒娃D(zhuǎn)移復發(fā)是乳腺癌難以根治的主要原因［5］。本研究通過檢測sHER-2在乳腺癌細胞中表達水平，建立不同表達水平的乳腺癌細胞系，并對其生物學特性進行研究分析，也可為臨床醫(yī)生使用靶向藥物提供依據(jù)。

目前曲妥珠單抗主要用于治療HER-2過表達的乳腺癌患者［6］。然而，并非所有患者都對此藥物敏感，原因可能是由于腫瘤細胞內(nèi)sHER-2表達水平的差異，致使在同一治療條件下患者的治療效果也會有所不同。

圖 4 高、中和低表達細胞生長情況Fig. 4 The cell growth status of sHER-2 high, medium and low expression cell clones

圖 5 高、中和低表達細胞侵襲能力Fig. 5 The invasion ability of sHER-2 high, medium and low expressions cell clones

圖 6 3組sHER-2檢測與CA153之間相關(guān)性比較Fig. 6 Correlation between sHER-2 and CA153 in 3 groups

本研究結(jié)果表明，乳腺癌細胞組和正常乳腺上皮細胞之間sHER-2表達水平差異顯著，本研究在乳腺癌細胞系中通過sHER-2檢測區(qū)分建立高、中和低表達水平的細胞株，再對三者進行進一步的生物學特性研究。通過克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，sHER-2高表達細胞株增殖更快。此外，本研究通過增殖遷移實驗和侵襲實驗發(fā)現(xiàn)sHER-2高表達細胞株的遷移和侵襲能力要明顯強于sHER-2中、低表達細胞株，與克隆形成實驗結(jié)果相符。王英哲等［7］的研究結(jié)果顯示，惡性乳腺癌中sHER-2高表達患者病情嚴重程度、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的概率以及預后等都要高于其他乳腺癌患者。本研究結(jié)果與該文獻報道結(jié)果一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高表達sHER-2的乳腺癌細胞具有促增殖、促細胞動力等生物學效應，在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。這一研究結(jié)果可為臨床上針對sHER-2表達不同患者合理使用靶向藥物治療提供數(shù)據(jù)支持及實驗依據(jù)，有關(guān)sHER-2高表達是否為乳腺癌預后不良的因子之一，還值得進一步研究、探索。

［1］ 袁 芃, 徐兵河, 齊 軍, 等. 乳腺癌患者血清與腫瘤組織中HER-2/neu表達的相關(guān)性研究［J］. 臨床腫瘤學雜志, 2004, 9(5): 49-52.

［2］ HYNES N E, MACDONALD G. ErbB receptors and signaling pathways in cancer［J］. Curr Opin Cell Biol, 2009, 21(2): 177-184.

［3］ REEDIJK M, ODORCIC S, CHANG L, et al. High-level coexpression of JAG1 and NOTCH1 is observed in human breast cancer and is associated with poor overall survival［J］. Cancer Res, 2005, 65(18): 8530-8537.

［4］ MURPHY C G, MODI S. HER-2 breast cancer therapies: a review［J］. Biologics, 2009, 19(6): 1068-1074.

［5］ 韓 銘, 鄧 華, 瑜隆玲, 等. 赫賽汀對乳腺癌SK-BR-3細胞Notch-1信號通路的影響及意義［J］. 中國腫瘤臨床, 2011, 38(11): 448-489.

［6］ 姜 擴, 王立鋒, 裘秀春, 等. HER-2與乳腺癌靶向治療的研究進展［J］. 實用癌癥雜志, 2010, 25(4): 109-125.

［7］ 王英哲, 司 文, 楊俊蘭, 等. 腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移前后激素受體、HER-2表達的改變及其臨床意義［J］. 解放軍醫(yī)學院學報, 2015, 12(5): 766-815.

The effect of different expression levels of HER-2 on the biological characteristics of breast cancer cells

ZHANG Jie, ZHENG Hui, LU Renquan, GUO Lin (Department of Clinical Laboratory, Fudan University Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Correspondence to: GUO LIN E-mail: guolin500@hotmail.com

Background and purpose: Human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) is the member of tyrosine kinase receptor family. Its differential expression plays the key role in choosing targeted drug for breast cancer. This study focused on screening the breast cancer cell clones of different HER-2 expression levels, and studying the biological characteristics of these cells. Methods: Breast cancer SK-BR-3 cells were clonally purified, and the expression level of soluble HER-2 (sHER-2) from the culture supernatant was detected by the ECLIA on ADVIA Centaur CP System. Cell clones with high expression (＞50.0 ng/mL), medium expression (15.8-50.0 ng/mL) and low expression (＜15.8 ng/mL) of sHER-2 were identified, respectively. This study observed the morphological changes of cell strains with differential expression levels of sHER-2 by cell culture. Besides, biological characteristics were compared by a series of experiments in vitro, such as clone formation, scratch assay, and transwell detection. Results: Compared with normal breast cells, sHER-2 was overexpressed significantly in SK-BR-3 breast cancer cells. Furthermore, the abilities of clone formation, mobility and invasion of sHER-2 high expression cell strain [(51.3±3.4)%, (50.0±0.6)% and (53.5±4.2)%] were significantly higher than those of sHER-2 medium expression [(42.0±3.7)%, (19.5±3.4)% and (33.2±3.9)%] or sHER-2 low expression [(26.7±2.9)%, (13.6±1.0)% and (28.9±5.4)%], and the differences were all statistically significant (P＜0.05).Conclusion: Breast cancer cell strain with high expression level of sHER-2 can enhance cell proliferation, promote cell motility and other biological effects, which may lay the foundation for clinical screening of targeted drug therapies for breast cancer.

Breast cancer; Soluble human epidermal growth factor receptor-2; Cell invasion; Proliferation; Migration

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.03.007

R737.9

A

1007-3639(2017)03-0201-06

2016-08-01

2016-11-30）

郭 林 E-mail:guolin500@hotmail.com