*侯佰立

(玉溪市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心 云南 653100)

煙草及煙草制品中糖的高效液相色譜分析

*侯佰立

(玉溪市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心 云南 653100)

綜述了煙草及其制品中糖的高效液相色譜分析的研究現(xiàn)狀、色譜條件優(yōu)化、樣品提取與純化等,為建立高效、準(zhǔn)確、靈敏度高的煙草糖檢測(cè)方法提供技術(shù)支撐.

煙草;糖;高效液相色譜

1.引言

煙草含糖量為40%左右,主要為水溶性糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖.在煙葉加工過(guò)程中,前3種糖和轉(zhuǎn)化糖(葡萄糖和果糖混合物)常被添加至煙草中.煙草添加劑如果汁、蜂蜜、焦糖也含有較高含量的糖.

糖特別是水溶性糖在煙草制品中可起到加香、使吃味醇和、調(diào)整煙氣焦油生成量和保潤(rùn)的作用,但糖含量過(guò)高反而會(huì)對(duì)煙草品質(zhì)產(chǎn)生不利影響,繼而損害吸煙者身體健康.因此,測(cè)定煙草及其制品中糖含量對(duì)提高卷煙品質(zhì)具有重要意義.本文從色譜條件和樣品制備兩方面對(duì)煙草及其制品中糖的HPLC分析研究進(jìn)展進(jìn)行了主觀綜述.

2.色譜條件

(1)檢測(cè)器

由于糖在紫外光區(qū)無(wú)吸收,且在煙草及其制品中含量較高,常選用示差折光檢測(cè)器(RID).但RID易受溫度、流動(dòng)相組成、流速等波動(dòng)的影響,不能進(jìn)行梯度洗脫,一定程度上影響檢測(cè)靈敏度、分離效能和準(zhǔn)確度.為彌補(bǔ)這一不足,如今HPLC-RID儀器已經(jīng)在流速恒定和光學(xué)元件溫度控制上有了一定的改進(jìn).黃翼飛把RID光學(xué)元件溫度保持在35℃.

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)是一種新型的通用檢測(cè)器,不要求恒溫恒流速、穩(wěn)定性好、靈敏度高,可進(jìn)行梯度洗脫,但使用成本較高.漂移管溫度和載氣流速是ELSD的兩個(gè)重要參數(shù).隨不同的煙草樣品和色譜柱,漂移管溫度多設(shè)置為80℃、85℃、90.7℃和95℃,載氣選用空氣,流速一般為1.5L/min、2.0L/min、2.1L/min,或選用N2,流速一般為2.0L/min、2.4L/min,可達(dá)到最小的噪聲信號(hào),色譜圖基線平穩(wěn).湯建國(guó)等建立的超高效液相色譜ELSD法中,漂移管溫度55℃、載氣N2壓力276kPa(40Psi).

(2)色譜柱與柱溫

常用色譜柱有三類(lèi):專(zhuān)用糖分析柱如Prevail糖柱、Alltech高效糖柱,柱長(zhǎng)25cm,柱內(nèi)徑4.6mm,填料顆粒5μm;氨基柱如Acquity UPLC BEH Amide柱(2.1mmX50mm,1.7μm)、Kromasil氨基柱(4.6mmX250mm,5μm)、High-Performance Carbohydrate卡套柱(4.6mmX250mm,4μm);陽(yáng)離子交換色譜柱,如鈣型色譜柱(Waters Sugar Pak1、Metacarb67C),柱長(zhǎng)30cm,柱內(nèi)徑6.5mm,及鉛型色譜柱(Varian Metacarb Pb PLUS,7.8mmX300mm).黃菲等比較了High-Performance Carbohydrate柱和Varian Metacarb Pb PLUS柱,發(fā)現(xiàn)使用后者和水流動(dòng)相可達(dá)到較低的檢測(cè)限,各糖可實(shí)現(xiàn)完全的基線分離,分離性好、色譜峰的保留時(shí)間穩(wěn)定.因?yàn)橄啾劝被?此柱在使用過(guò)程中柱流失極小,所以檢測(cè)基線波動(dòng)極小,靈敏度較高.鈣型陽(yáng)離子交換色譜柱Waters Sugar Pak1,通過(guò)體積排阻、配位交換的雙重分離機(jī)理,可使各低聚糖組分分離.黃翼飛、黃菲等比較了Sugar Pak1 與Metacarb 67C兩根鈣型陽(yáng)離子交換色譜柱,發(fā)現(xiàn)后者使用簡(jiǎn)便、分析效果和重現(xiàn)性較好.程勇等采用的Prevail糖柱沒(méi)有化學(xué)降解現(xiàn)象,在室溫及梯度洗脫情況下亦很穩(wěn)定.

(3)流動(dòng)相、流速、洗脫方式

糖柱、氨基柱流動(dòng)相多為70%～80%(體積比)乙腈水混合溶液,流速多為1.0mL/min～1.5mL/min,常使用等度洗脫方式,采用ELSD時(shí)可采用梯度洗脫方式.黃翼飛使用預(yù)混的乙腈水溶液作為流動(dòng)相,并在使用超過(guò)24h后,重新配制或按1%左右的體積比例添加適量的乙腈,色譜基線波動(dòng)較小,保留時(shí)間等參數(shù)較穩(wěn)定.周元清等發(fā)現(xiàn),用乙腈水作流動(dòng)相效果好于用甲醇水,流動(dòng)相為70%乙腈水,流速為1.0mL/min,得到色譜峰形較好,各組分實(shí)現(xiàn)基線分離、分離性好,分析時(shí)間合適,提高了分析靈敏度.湯建國(guó)、毛智慧等選擇梯度洗脫方式,以水(A相)-0.2%三乙胺/乙腈(B相)體系作為流動(dòng)相,流速0.15 mL/min,結(jié)果滿意.

陽(yáng)離子交換色譜柱常用超純水為流動(dòng)相、低流速等度洗脫,水便于隨時(shí)更換,經(jīng)濟(jì)、安全、清潔環(huán)保,檢測(cè)條件恒定,能提高RID的靈敏度及檢測(cè)重現(xiàn)性.高流速可以縮短分析時(shí)間,但會(huì)使柱壓大大升高,且可能降低目標(biāo)色譜峰與雜質(zhì)峰的分離度.黃菲等使用Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱,流速為0.4mL/min.Waters Sugar Pak1鈣型陽(yáng)離子交換柱在流動(dòng)相水中加入少量EDTA鈣鈉可減少柱材料上的鈣離子流失,延長(zhǎng)柱的壽命.但黃翼飛、黃菲等發(fā)現(xiàn),分析時(shí)間大于1天時(shí),為防止CO2等氣體溶入,需要加溫使流動(dòng)相溫度維持在70℃以上,隨之引起EDTA鈣鈉濃度變大,使得糖保留時(shí)間發(fā)生改變,引起基線波動(dòng).

3.樣品制備

(1)提取

提取溶劑主要有水、NaOH溶液、有機(jī)溶劑(如乙醇、甲醇、乙腈)與水的混合溶液.常采用水浴加熱和超聲/回旋振蕩來(lái)提高提取效率.

煙草樣品中的糖可用70%乙醇超聲輔助提取,但由于色素也溶于其中,會(huì)降低檢測(cè)器靈敏度.目前多數(shù)研究中采用水作為提取劑,王璐等研究發(fā)現(xiàn),在40℃～50℃下,水超聲浸取30min即可使糖完全溶出,且多糖水解率很低,保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,糖提取液最好在當(dāng)天測(cè)定.程勇等研究發(fā)現(xiàn),用55%乙腈水溶液作溶劑,1-鼠李糖等8種糖溶解性均較好,在選定的液相條件下,8種糖的色譜峰的拖尾因子值均在1.03～1.2之間,各峰間分離度值≥1.4,明顯優(yōu)于用水、85%乙腈水溶液作溶劑.

0.01mol/L NaOH溶液也是常用的提取劑,與水相比,二者提取效率相當(dāng),但前者有利于防止蔗糖在煙草樣品提取液放置時(shí)發(fā)生水解,確保測(cè)試結(jié)果的真實(shí)性.

(2)純化

煙草樣品中除了糖,還含少量其他成分(如植物堿、酚類(lèi)、醛酮、蛋白質(zhì)、油脂、色素、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)鹽、顆粒物等),為消除干擾,減少這些物質(zhì)對(duì)色譜柱的污染,需要進(jìn)一步純化提取液.過(guò)去用乙酸鉛沉淀單寧、蛋白質(zhì),再用飽和草酸鈉除去過(guò)量的乙酸鉛.近年來(lái),固相萃取(SPE)逐漸成為純化樣品的首選方法.毛智慧等比較了ODS-C18、Waters Sep Pak- C18、Oasis MCX和Waters Oasis HLB固相萃取小柱,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Waters Oasis HLB固相萃取小柱效果較好.殘余少量的有機(jī)酸和無(wú)機(jī)鹽等用SEP-PAK Alumin Cartridges保護(hù)柱在線除去.

以上,研究者對(duì)測(cè)定煙草及其制品中糖的HPLC法進(jìn)行了線性關(guān)系與檢出限分析、精密度試驗(yàn)、加標(biāo)回收率試驗(yàn)等.這些方法的線性范圍均比較寬,線性相關(guān)系數(shù)一般在0.999以上,檢出限一般為0.1～1μg/mL級(jí),精密度RSD基本小于5%(n≥5),回收率多數(shù)在100%左右,說(shuō)明這些方法準(zhǔn)確度高,重復(fù)性較好,適用范圍較廣,靈敏度較高,有的檢出限甚至低至10ng,RSD低至0.44%～0.90%.但有的方法對(duì)有的糖回收率稍低、檢出限稍高,相關(guān)系數(shù)也略小,說(shuō)明方法還需要改進(jìn).

[1]魏玉磊.煙草中糖對(duì)主流煙氣成分的影響研究[J].食品工業(yè),2010,(3):62-64.

[2]黃冀飛.高效液相色譜法測(cè)定煙草中的果糖、葡萄糖和蔗糖[J].煙草化學(xué),2010,(1):40-43.

[3]S Cardenas,M Gallego,M Valcarcel.Anal Chim Acta,1999,402:1.

侯佰立(1985-),女,玉溪市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心;研究方向:食品與化工產(chǎn)品的檢驗(yàn).

HPLC Analysis of Sugar in Tobacco and Tobacco Products

Hou Baili
(Yuxi city quality technical supervision integrated testing center, Yunnan , 653100)

This paper roundups the research status of the high performance liquid chromatography analysis of sugar in tobacco and tobacco products, optimization of chromatographic conditions and sample extraction and purification, providing technical support for establishing a high efficiency, accurate and high sensitivity detection method of tobacco sugar.

tobacco;sugar;high performance liquid chromatography (HPLC)

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