樓 堅(jiān),申雨珂,劉夢(mèng)云,靳羽曉,葉劍欽,尤玉如,毛建衛(wèi),劉士旺

(1.浙江科技學(xué)院 生化學(xué)院/輕工學(xué)院,浙江 杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310023; 3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310023)

牛乳中嗜冷菌的PCR快速檢測(cè)

樓 堅(jiān)1,2,3,申雨珂1,2,3,劉夢(mèng)云1,2,3,靳羽曉1,2,3,葉劍欽1,2,3,尤玉如1,2,3,毛建衛(wèi)1,2,3,劉士旺1,2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生化學(xué)院/輕工學(xué)院,浙江 杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310023; 3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310023)

利用選擇性培養(yǎng)基分離牛乳中的嗜冷菌,通過形態(tài)學(xué)特征觀察和生理生化試驗(yàn)鑒定分離株,判斷分離株為桿菌屬和球菌屬.根據(jù)菌屬基因序列設(shè)計(jì)PCR引物,提取基因組DNA進(jìn)行PCR快速檢測(cè),通過測(cè)序比對(duì)確定分離株為嗜冷桿菌和腐生葡萄球菌.

牛乳;嗜冷菌;PCR

嗜冷菌污染是大規(guī)模液態(tài)乳工業(yè)化生產(chǎn)面臨的難題.大多數(shù)嗜冷菌在低溫貯藏時(shí)產(chǎn)生耐熱性的胞外蛋白酶,這些酶能耐受巴氏消毒甚至UHT處理,使乳產(chǎn)生凝膠、沉淀、苦味和酸敗等現(xiàn)象,并影響產(chǎn)品色澤,導(dǎo)致乳及乳制品風(fēng)味、質(zhì)地變異,保質(zhì)期縮短,從而影響乳產(chǎn)品質(zhì)量及加工過程的順利進(jìn)行[1-2].

不同地區(qū)和不同的奶牛飼養(yǎng)方法等都對(duì)牛乳中嗜冷菌種類和數(shù)量具有一定的影響.要減少嗜冷菌的危害,早期對(duì)原料乳中嗜冷菌的檢測(cè)和控制是關(guān)鍵.但當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),也沒有快速的檢測(cè)方法.目前,嗜冷菌的檢驗(yàn)大多采用傳統(tǒng)粗放的方法,即在5～7 ℃培養(yǎng)10 d后計(jì)數(shù).該方法的缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力,對(duì)操作技術(shù)的要求高,在實(shí)際生產(chǎn)中存在嚴(yán)重滯后的問題,往往是檢測(cè)尚未完成,原料奶已是成品,有的或許已進(jìn)入市場(chǎng).由于乳制品為保鮮類產(chǎn)品,生產(chǎn)周期短,大多在10 d以內(nèi),巴氏殺菌奶則更短,一般在2～3 d內(nèi),因此建立一種快速鑒定檢測(cè)嗜冷菌的方法十分必要[3-4].筆者研究了乳品中微生物嗜冷菌的分離和快速鑒定方法,對(duì)開展嗜冷菌快速檢測(cè),有效控制嗜冷菌對(duì)原料奶和乳制品的危害,提高乳制品質(zhì)量和安全具有一定的理論和實(shí)際意義.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑及儀器

氯仿,杭州高晶精細(xì)化工有限公司;異戊醇,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇,安徽安特生物化學(xué)有限公司;十二烷基磺酸鈉,廣東汕頭西隴化工廠;十六烷基三甲基溴化銨,上海伯奧生物科技有限公司;Tris,上海思吉生物制品有限公司;乙二胺四乙酸二鈉,天津頂?；た倧S;2,3,5-氯化三苯基四氮唑,上海華東師范大學(xué)化工廠;質(zhì)粒提取試劑盒,AXYGEN;紫外透射分析儀,上海精科實(shí)業(yè)有限公司;PCR儀,杭州博日科技有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,瓊脂15～20 g,水1 000 mL;pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min.

CVT固體培養(yǎng)基:酵母膏2.5 g,蛋白胨5.0 g,葡萄糖1.0 g,結(jié)晶紫0.001 g,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.05 g,瓊脂15～20 g,水1 000 mL,pH 6.0,121 ℃滅菌20 min.

甲基紅試驗(yàn)液體培養(yǎng)基:蛋白胨5 g,葡萄糖5 g,K2HPO45 g,水1 000 mL,pH 7.0～7.2,每試管分裝4～5 mL,121 ℃滅菌20 min.

肉汁胨液體培養(yǎng)基:牛肉浸膏3 g,蛋白胨10 g,水1 000 mL,pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min.

淀粉培養(yǎng)基:在肉汁胨固體培養(yǎng)基中加0.2%可溶性淀粉,121 ℃滅菌20 min.

硝酸鹽還原試驗(yàn)液體培養(yǎng)基:肉汁胨液體培養(yǎng)基1 000 mL,KNO31 g,pH 7.0～7.6,每試管分裝4～5 mL,121 ℃滅菌20 min.

吲哚試驗(yàn)液體培養(yǎng)基:1%胰胨水溶液,pH 7.2～7.6,分裝1/4～1/3試管,121 ℃滅菌20 min.

1.2 方 法

1.2.1 樣品乳中嗜冷菌的分離方法

采用稀釋涂布與劃線分離結(jié)合的方法,分離純化牛乳中的嗜冷菌后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及生理生化試驗(yàn).

1) 稀釋:取1 mL樣品乳和9 mL無菌水于無菌空三角燒瓶中稀釋混勻.

2) 涂布培養(yǎng):取0.1 mL稀釋樣品乳涂布在牛肉膏蛋白胨和CVT平板培養(yǎng)基表面,在4,15,20 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),挑取單菌落,分離純化培養(yǎng),標(biāo)注菌種來源、培養(yǎng)時(shí)間和溫度.

1.2.2 分離株的系統(tǒng)鑒定方法

單菌落分離純化數(shù)次后,挑取菌落細(xì)胞進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,并進(jìn)行生理生化試驗(yàn)(接觸酶試驗(yàn)、甲基紅(M.R)試驗(yàn)、V-P測(cè)定、硝酸鹽還原試驗(yàn))[4].

1) 接觸酶試驗(yàn):以鉑絲接種環(huán)取一小環(huán)培養(yǎng)24 h的分離株斜面菌種,涂抹于已滴有3%過氧化氫的玻片上,如有氣泡則為陽性,無氣泡為陰性.

2) 甲基紅(M.R)試驗(yàn):將分離株菌種接種于甲基紅(M.R)試驗(yàn)液體培養(yǎng)基中,室溫下培養(yǎng)2～6 d(如為陰性可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間).培養(yǎng)后,在培養(yǎng)液中加入一滴甲基紅試劑,紅色為陽性,黃色為陰性.

3) V-P測(cè)定:接種和培養(yǎng)方法同甲基紅(M.R)試驗(yàn).培養(yǎng)后,將培養(yǎng)液和40%氫氧化鈉等量混合.加少許肌酸,反應(yīng)10 min,如紅色為陽性,無色為陰性.

4) 淀粉水解試驗(yàn):取分離株斜面菌種接種于淀粉培養(yǎng)基上,室溫培養(yǎng)2～5 d,形成明顯菌落后,滴加碘液.菌落周圍呈不變色透明圈為陽性,無透明圈為陰性.

5) 硝酸鹽還原試驗(yàn):將分離株斜面菌種接種于硝酸鹽還原試驗(yàn)液體培養(yǎng)基中,室溫下培養(yǎng)1,3,5 d,另做空白對(duì)照.在干凈的空試管或在比色瓷盤小窩中倒入培養(yǎng)液并加一滴格里斯氏(Griess)試劑A液及B液.溶液如變成粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色等表示亞硝酸鹽存在,為硝酸鹽還原陽性反應(yīng).如無紅色出現(xiàn),則繼續(xù)加1～2滴二苯胺試劑,此時(shí)溶液呈藍(lán)色表明培養(yǎng)液中有硝酸鹽,無硝酸鹽還原作用,為硝酸鹽還原陰性反應(yīng);如不呈藍(lán)色表明硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已還原成其他物質(zhì),故仍應(yīng)按硝酸鹽還原陽性反應(yīng)處理.

6) 吲哚試驗(yàn):將分離株斜面菌種接種于吲哚試驗(yàn)液體培養(yǎng)基中,室溫下培養(yǎng)1,2,4,7 d.培養(yǎng)后,沿管壁緩慢加入3～5 mm高的吲哚試劑于培養(yǎng)液表面,在液層界面產(chǎn)生紅色為陽性,無紅色為陰性.

1.2.3 基因組DNA的快速提取

目前實(shí)驗(yàn)室中采用的細(xì)菌DNA的提取方法有多種,主要有沸水法、酚-氯仿法、試劑盒法、Chelexl00法、CTAB/NaCl法等[5].本實(shí)驗(yàn)采用試劑盒法.

引物序列:根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道,利用軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),如表1所示.

表1 ISR引物序列

PCR反應(yīng):根據(jù)擴(kuò)增條帶的強(qiáng)弱改變反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,重復(fù)擴(kuò)增反應(yīng)[7],建立20 μL的PCR最佳體系和條件,如表2所示.

表2 PCR反應(yīng)體系1)

注:1) 反應(yīng)條件為變性95 ℃,3 min;后35個(gè)循環(huán)為94 ℃,30 s,56 ℃,30 s，72 ℃,70 s;后延伸72 ℃,10 min.

電泳和成像:將樣品液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,EB染色20～25 min,拍攝并觀察染色后的凝膠電泳圖像.

DNA回收:采用EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit過柱回收DNA.

測(cè)序:由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜冷菌的分離鑒定

分離株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征為乳白色或濕土色,透明或半透明,表面光滑,邊緣平滑整齊;在CVT選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落特征為紅色,呈高粱米粒大小,革蘭氏染色后鏡檢陽性和陰性均有.嗜冷菌在20 ℃下培養(yǎng)1～2 d有可見菌落生成;在15 ℃下培養(yǎng)3～5 d有可見菌落生成;在4 ℃下培養(yǎng)7～10 d有可見菌落生成.生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定如表3所示,查閱手冊(cè)判斷為以桿菌屬和球菌屬為主[4].

表3 嗜冷菌培養(yǎng)特征、鏡檢和生理生化反應(yīng)結(jié)果

2.2 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的建立

對(duì)#02,#05和#06分離株應(yīng)用ML-ISR-F/ML-ISR-R引物分別在不同退火溫度下擴(kuò)增,以建立最佳PCR反應(yīng)體系,結(jié)果如圖1所示.圖1中上樣(從左至右)為-CK,Mark,#02.1,#02.2,#02.3,#05.1,#05.2,#05.3,#06.1,#06.2,#06.3.結(jié)果表明:在56 ℃退火溫度下,PCR擴(kuò)增條帶最好.選定56 ℃為退火溫度,重復(fù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見如圖2所示,圖2中上樣(從左至右)為Mark,#02.1,#02.2,#02.3,#05.1,#05.2,#05.3,#06.1,#06.2,#06.3，可見#05和#06擴(kuò)增條帶大小相同,與#02有顯著差異.#06.1出現(xiàn)雜帶,可能由于基因組污染.

圖1 分離株在不同退火溫度下PCR擴(kuò)增凝膠電泳成像圖Fig.1 The gel electrophoresis image for PCR amplification of the isolates at different annealing temperatures

2.3 測(cè)序比對(duì)結(jié)果

對(duì)分離株16S RNA擴(kuò)增后測(cè)序,對(duì)比圖譜如圖3～5所示.從圖3比對(duì)圖譜上可以看出:#02分離株16S RNA序列與已公布的Staphylococcus

圖2 分離株P(guān)CR擴(kuò)增凝膠電泳成像圖 Fig.2 The gel electrophoresis image for PCR amplification of the isolates

saprophyticussub sp.SaprophyticusATCC 15305 DNA序列同源性極高(96%),可能是葡萄球菌屬的腐生葡萄球菌.該菌株未在相關(guān)嗜冷菌研究文獻(xiàn)報(bào)道中出現(xiàn),即可能是乳樣品在取樣過程中受污染,也可能存在于乳樣品中.實(shí)驗(yàn)中,它能在低溫下生長(zhǎng),且在CVT培養(yǎng)基上生良好,其嗜冷性有待進(jìn)一步研究與確證.從圖4,5比對(duì)圖譜上可以看出:#05和#06分離株16S RNA序列高度同源,且與已公布的Psychrobacterarcticus373-4 16S RNA序列同源性最高(88%).結(jié)合其培養(yǎng)特征和系統(tǒng)鑒定結(jié)果,確定#05和#06分離株為嗜冷桿菌屬(Psychrobactersp.).若要進(jìn)行屬種的詳細(xì)鑒定,可參照文獻(xiàn)[8]的相關(guān)方法.

圖3 #02分離株基因序列比對(duì)圖譜Fig.3 The map of #02 isolates gene sequence alignment

圖4 #05分離株基因序列比對(duì)圖譜Fig.4 The map of #05 isolates gene sequencing alignment

3 結(jié) 論

嗜冷菌在工業(yè)生產(chǎn)、食品加工、環(huán)境保護(hù)等與人類生活息息相關(guān)的領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用和廣闊的發(fā)展前景.雖然大多數(shù)嗜冷菌在貯存時(shí)會(huì)產(chǎn)生耐受巴氏消毒甚至超高溫(UHT)瞬時(shí)滅菌處理的酶類(蛋白酶和脂肪酶),這將影響乳制品工業(yè)的發(fā)展.但嗜冷菌的特殊性質(zhì),使其在工業(yè)生產(chǎn)的諸多領(lǐng)域有著相當(dāng)大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),如低溫下催化反應(yīng)可防止污染(同源的嗜溫酶不活潑),經(jīng)過溫和的熱處理即可使嗜冷酶的活力喪失,因此低溫或適溫處理不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)[9].近年來有關(guān)低溫微生物的研究日益增多,相信隨著研究的持續(xù)深入以及生物工程技術(shù)的充分利用,低溫微生物在生物技術(shù)及生命科學(xué)研究中的地位將會(huì)越來越重要[10].因此,若能對(duì)嗜冷菌進(jìn)行深入研究,則既能有效地控制有害嗜冷菌,又能積極地應(yīng)用有益嗜冷菌.

圖5 #06分離株基因序列比對(duì)圖譜Fig.5 The map of #06 isolates gene sequencing alignment

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

PCR rapid detection of psychrophilic bacteria in cow’s milk

LOU Jian1,2,3, SHEN Yuke1,2,3, LIU Mengyun1,2,3, JIN Yuxiao1,2,3, YE Jianqin1,2,3, YOU Yuru1,2,3, MAO Jianwei1,2,3, LIU Shiwang1,2,3

(1. School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Product, Hangzhou 310023, China; 3. Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing, Hangzhou 310023, China)

Psychrophilic bacteria were isolated from the cow’s milk by CVT selective medium, and the isolated strains were identified as bacillus and coccus through morphological observation and common physiological and biochemical experiment. It was further identified asPsychrobactersp. andSaprophyticussub sp. by PCR rapid detection with primers designed according to gene sequence.

Cow’s milk; psychrophile; PCR

2016-10-11

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201311057009);浙江省教育廳科研項(xiàng)目(Y201224264);浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金(2016KF0032);浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(2013KF034)

樓 堅(jiān)(1980—),男,浙江杭州人,講師,研究方向?yàn)樯锕こ?、工業(yè)微生物,E-mail:loujianzust@126.com.通信作者:劉士旺教授,E-mail:shiwangliu@163.com.

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1674-2214(2017)01-0036-06